細菌自動鑒定及藥敏係統的研究進展(1)

一、細菌自動鑒定及藥敏係統的發展史

細菌的鑒定是細菌分類的實驗過程，長期以來，臨床微生物實驗室一直沿用100多年前由Gram、Pasteur、Koch、Petri等創造的傳統的微生物學鑒定方法。這些傳統的鑒定方法不僅過程煩瑣，費時費力，且在方法學和結果的判定、解釋等方麵易發生主觀片麵而引起的錯誤，難以進行質量控製。

20世紀60年代以後，微生物學家和工程技術人員密切合作，對微生物的研究采用了物理的、化學的分析方法，發明了許多自動化儀器，並根據細菌不同的生物學性狀和代謝產物的差異，逐步發展了微量快速培養基和微量生化反應係統，使原來緩慢、煩瑣的手工操作變得快速、簡單，並實現了自動化和機械化。微生物鑒定自動化方法，包括(1)臨床微生物鑒定係統；(2)氣液色諳分析；鑒定厭氧菌和分枝杆菌多用於研究；(3)核酸雜交；多用於研究；(4)化學發光技術；可鑒定一些細菌少數分枝杆菌屬和一些真菌。80到90年代發展迅速，並廣泛用於臨床。1985年第一台自動化細菌分析儀器Vitek-AMS進入中國並成功使用。1999年底法國梅裏埃公司推出VITEK2係統，從接種物稀釋、密度計比較及卡衝填和封卡等步驟均實現了全自動化。目前已有多種微生物自動鑒定及藥敏測試係統問世，如VITEK-AutoMicrobicSystem(AMS)、PHOENIXTM、MicroScan、Sensititre、ABBott(MS-2 System)、AUTOBACIDXSys-tern等。這地自動化係統具有先進的微機係統，廣泛的鑒定功能，適用於臨床微生物實驗室、衛生防疫和商檢係統，主要功能包括細菌鑒定、細菌藥物敏感性試驗及最低抑菌濃度(MIC)的測定等。其準確性和可靠性均已大大提高。

二、細菌自動鑒定及藥敏係統原理及性能比較

1.原理：

臨床微生物鑒定係統使細菌鑒定過程規範化和程序化，將細菌對底物的生化類型與已建立數據庫類型相比較。測試原理主要是利用物質產生PH值變化，能釋放色源或熒光源複合物的酶學反應，四氮唑標記碳水化合物代謝活性的產生，揮發或非揮發酸產生，或可見生長。

2．采有上述原理的各種鑒定係統可鑒定腸杆菌科菌。 目前較完善的鑒定係統性能比較。非發酵菌，革蘭陽性球菌，革蘭陰性球菌，厭氧菌和酵母

 

三、常見細菌自動鑒定及藥敏係統工作原理

 

（一）半自動微生物鑒定和藥敏係統

 

1．VITEK-ATB

 

　　ATB鑒定係統是將肉眼觀察的結果輸入電腦，計算機數據庫由許多細菌條目(taxa)組成，將輸入結果與數據庫內細菌條目比較，自動地得到鑒定結果。ATB敏感性試驗采用半固體瓊脂培養叢，不同的藥敏試條含有不同種類的抗生素，每種抗生素都設有兩個關鍵性的濃度，在24小時內通過觀察有(+)無(一)細菌生長以判斷藥敏試驗結果。結果可直接判讀為：敏感，中介或耐藥。由讀數儀和電腦兩部分組成。係統是由API金標準改良而成，擁有龐大的細菌資料庫以及嚴格的質控，可鑒定多達550種細菌。另外，ATB係統操作方便，隻需將培養結果輸入電腦，就可得到結果。

 

2．MicroScan Panel

 

　　使用測試板及快速接種係統，人工判讀，將編碼結果輸入電腦，由電腦軟件得出反應結果。操作簡便，價格便宜。

 

3．Sensititre ManualSystem(手動裝置)原理和操作方法同以上兩種半自動方法。

 

（二）自動微生物鑒定和藥敏係統

 

1．AutoScan-4自動微生物鑒定／藥敏分析儀

 

　　試劑板在培養箱孵育，然後放主機，用比色法及比濁法對鑒定及藥敏(MIC)進行測定，96條不同波長光導纖維，對96孔板同時測定。儀器由主機，電腦和打印機組成。

將菌液加入試劑板，放培養箱孵育(35～C左右)18～24小時。將試劑板放入主機，儀器自動判讀結果。可同時做鑒定和藥敏，自動判讀結果，操作簡便。

 

2．AutoReader自動微生物鑒定／藥敏分析儀

 

　　用熒光檢測技術，在測定板底物中加入入酶介物，使其與細菌生長中的酶結合生成熒光物質。熒光物質通過熒光讀數儀得出的生物編碼（BIOCODE）來判定菌種。

 

（三）Vitek-AMS（Automated Microbic System）全自動細菌鑒定和藥敏分析係統工作原理

 

1．概況：

 

　　Vitek-AMS（Automated Microbic System）全自動細菌鑒定和藥敏分析係統，1960年由美國航天係統的麥克唐納，道格拉斯公司為了鑒定宇宙環境中的微生物而研製的。1973年正式應用於臨床微生物檢驗。1989年該係統由麥克唐納，道格拉斯公司轉讓給法國生物梅裏埃集團。全世界有4246家實驗室應用，國內用戶110台。(1996年資料) 自1985年第一台自動化細菌分析儀器Vitek-AMS進入中國並成功使用。價格7．8萬美元。

 

2．結構組成

 

　　VITEK CC4自動鑒定係統由菌液接種、封閉裝置(此裝置分上下兩部分，下部分為真空室，上部是一熱切割器)．讀數器、孵箱和電腦、打印機三部分組成。

 

(1)充液/封口部件 這一部件分為上、下兩部分。上部為封口器並有切割作用，下部為真空充液接種裝置。將製備好菌懸液的試管和試卡用一彎形塑料管相連並置充液接種倉中，當接Fill鈕時，即開始抽真空，真空形成後進氣閥開放，倉內形成負壓，菌液從試管通過彎形塑料管進入試卡內即完成接種，上部封口為一熱切割器，溫度可升至200℃以上，完成按種的試卡可置熱切割器中，密閉並切割平整。

 

(2)孵箱／讀數器 孵箱內有一直立圓形轉盤，每隔900置一卡片架，每個孵箱共可放4個卡片架，每一個卡片架分別用 A、B、C、D標記，每—卡片架可放32張測試卡。孵箱直接由計算機控製，讀數器是665nm波長的光掃描器，每15min自動掃描一次，並將光信號轉換為電信號傳送至計算機。

 

(3)計算機、終端和鍵盤 計算機就像整個係統的神經中樞，始終保持與孵箱／讀數器、打印機和終端的聯絡，控製孵箱溫度，自動定時讀數，收集記錄，儲存和分析資料。當卡片反應完成時，計算機可指示打印機自動打印報告。使用者可隨時從終端查詢試卡檢測結果，配有IMS裝置的計算機還具有數據統計功能，該係統計算機還可同時帶動兩個孵箱／讀數器並可與自動免疫診斷係統——VIDAS聯用。終端是由21cm彩色顯像管組成。終端可提供人機對話並與各部件聯絡，當係統出現故障會自動報警。鍵盤為102標準鍵擻，通過鍵盤可建立適合各類實驗室的框架。輸入指令或菜單，控製係統的運動狀態，輸入各檢測樣本的流行病學資料。

 

(4)打印機 打印機始終與計算機保持聯絡，接受計算機發出的命令，自動打印每一試卡的最終報告，包括實驗室保留的short report和發給臨床醫生的patient report，並自動打印係統出現的故障資料。

 

3．原理

 

(1)鑒定原理：

 

　　常規革蘭剛(陰)性板對各項生化反應結果(陰性或陽性)的判定是根據比色法的原理，將菌種接種到鑒定板後進行培養，由於細菌各自的酶係統不同，新陳代謝的產物也有所不同，而這些產物又具有不同的生化特性，因此各生化反應的顏色變化各不相同。儀器自動每隔1小時測定每—生化反應孔的透光度，當生長對照孔的透光度達到終點閾值時，指示已完成反應。由光電技術、電腦技術和細菌八進位製數碼鑒定相結合。每個鑒定卡內含有30項生化反應，每3項為一組，各確立陽性反應值為1、2、4：如3項反應全部陽性，其組值為7；如第1、2項反應陽性，其組值為3；第1、3項反應陽性，其組值為5。30項生化反應可獲得10位數的生物數碼，在鑒定時有時還需外加補充試驗，共可獲得11位生物數碼，係統將其最後一次判讀的結果所得生物數碼與菌種資料庫標準菌生物模型相比較，得到鑒定值和鑒定結果，並自動打印出實驗報告和發給病人的病房報告。

 

(2)藥敏實驗原理

 

　　藥敏測試板(卡)的藥物敏感性試驗實質是微型化的肉湯稀釋試驗。應用光電比濁原理，根據不同的藥物對不同的菌最低抑菌濃度不同，每一種藥物一般選用3種不同藥物濃度，每一藥敏試卡可同時作10種藥物的MIC(minimal inhibitory concentration)測定，經6小時孵育後，每隔一定時間自動測定小孔中細菌生長狀況，即可得到待測菌在各濃度的生長率。待檢菌斜率與陽性對照孔斜率之比值，經回歸分析得到MIC值，並根據NCCLLS(美國國家臨床實驗室標準化委員會)標準獲得相應的S、I和R結果。藥敏報告含MIC值，敏感度，藥物一次劑量和在該劑量下的血清和尿液內最高藥物濃度。

 

4．主要操作步驟

 

(1)光電比濁儀

 

　　革蘭氏陽性菌配製相當0.5麥氏管菌懸液，革蘭氏陰性菌配製相當1麥氏管菌懸液、酵母菌配製相當2麥氏管菌懸液，厭氧菌配製相當大於2麥氏管菌懸液。

 

(2)菌液接種和封閉

 

(3)卡片裝入讀數器／孵箱。

 

(4)輸入病人人口統汁學資料。

 

(5)自動打印實驗室和病人報告。

 

5．係統功能和特點

 

(1)鑒定功能

 

　　係統具有對不同菌類的鑒定能力，含有鑒定試卡十種，包括

 

A．GNI卡(革蘭氏陰性杆菌)：可鑒定腸道菌和非發酵菌117種。

B．GPI卡(革蘭氏陽性球菌)：可鑒定葡萄球菌、鏈球菌及其他細菌49種。

C．YBC卡(酵母菌)：可鑒定酵母樣真菌36種。

D．BAC卡(需養芽孢杆菌)：可鑒定芽孢杆菌12種。

E．ANI卡(厭氧菌)：可鑒定87種。

F．NIH卡(奈瑟氏菌、嗜血杆菌)：可鑒定奈瑟氏菌、嗜血杆菌和其它苛氧菌30種。

G．NFC卡(非發酵型革蘭氏陰性細菌)：可鑒定非發酵型革蘭氏陰性細菌。

H．GNI+卡：快速革蘭氏陰性菌鑒定卡。

　篩選卡

L．UID-3卡：尿道感染專用鑒定和藥敏卡

M．ESP-3卡：腸道病原菌

 

　　可鑒定不同種類的細菌近500種。係統設計，直接同樣本鑒定，使結果提前二十四小時，並報告菌落計數，鑒定功能和參考方法比可獲得百分之九十五以上的相關率。

 

(2)藥敏試驗

 

　　革主氏陰性杆菌藥敏試二十種，革蘭氏陽試卡三種，尿道分離菌藥敏試卡，超廣譜(—內酰胺酶試卡，最近又開發出四十五孔試卡。涉及為九十七種抗生素，並含有測定超廣譜(—內酰胺酶(ESBL)功能的試卡(GNS—NT)。在革蘭氏陽性菌藥敏試卡中含有(—內酰胺酶試驗。

 

(3)專家係統軟件

 

　　所謂專家係統是用計算機軟件來代替有豐富經驗的專家審核，該係統產生報告中的技術錯誤和異常的藥物表型，TITEK專家係統有144條規則，規則分為三級水平，一級水平是極不可能出現的表型，二級是罕見表型，三級是利用一種藥物表型推理另外一些藥物的耐藥性。專家係統規則，每天審核異常藥敏規則，使檢驗醫生可對報告進行修訂或重複處理。

 

(4)數據處理軟件

 

　　可根據用戶需要，打印出二十八種流行病學和統計報告，統計報告內容是：菌種發生率報告、抗生素敏感率統計報告、細菌對抗生素累積敏感率報告、細菌對抗生素累積MIC報告、每月細菌發生率報告、每月細菌敏感率報告、工作量報告、生物模式統計報告、根據不同試卡種類統汁的敏感性報告。

 

(5)優點：

 

　　結果檢出迅速，最快2-4小時鑒定出結果，準確度高，本機設有專家係統軟件，該係統匯集了細菌學家、藥學家及基礎醫學家智慧而研製的軟件，用於審核評價現時藥敏報告中耐藥表型的可能性和正確性。多種形式的結果統計，幫助細菌室了解院內某種細菌的感染率、細菌的耐藥趨勢等情況。

 

6．注意事項

 

(1)首先一定要調驗好光電比色計0點和100％點。

(2)細菌一定要純。(菌落不純一定要分純後再上儀器鑒定。)

(3)儀器報警一定要及時處理。

 

7．儀器保養

(1)每日用布水擦機身，每周沾70％酒精擦填充器。

(2)2-3各月用無水乙醇擦鏡片。

(3)1—2個月用清洗帶清洗備份磁頭。