【摘要】 目的 探討微生物檢驗比對考核的檢驗思路。 方法 以2005年廣東省疾病預防控製中心組織的微生物實驗室間比對試驗為例，對3號項目考核樣品使用現行有效的微生物檢驗技術規範和相關傳染病診斷標準進行鑒定。 結果 根據組織單位提供的已知提示，並充分利用自己的已知知識，盡量縮小範圍，檢出3號項目考核樣品是宋內誌賀菌Ⅰ相和福氏誌賀菌2a型的混合菌株。 結論 參加微生物檢驗比對考核時要充分利用已知知識進行檢驗，並要留意樣品是純菌株還是混合菌株。
【關鍵詞】 比對考核;宋內誌賀菌Ⅰ相;福氏誌賀菌2a型;混合菌株;純菌株
在微生物檢驗中，無論是日常工作或是比對考核，如果不知菌株來源，即不知菌株采集於人體何部位，采集於何種食物、使用物品或環境時，對未知菌株的分離鑒定，目前沒有固定的檢驗程序［1～4］ ，隻有在確定了菌株的來源或針對性要檢驗某個可疑菌屬，才有相關來源菌的檢驗流程［1］ 或相關菌屬的檢驗程序 ［2］ 。微生物檢驗比對考核一般說明菌株來源或指明了某一方向，對未知菌株進行鑒定時可以根據這些提示來縮小檢驗範圍。下麵以2005年廣東省疾病預防控製中心組織的微生物實驗室間比對試驗為例，探討微生物檢驗比對考核的檢驗思路。對3號項目考核樣品進行檢驗，檢驗思路和檢驗結果如下。
1 對象、試劑、儀器和方法
1.1 對象 廣東省疾病預防控製中心提供的比對考核3號項目考核樣品。
1.2 試劑 各種微生物檢驗用染色液試劑、增菌培養基試劑、分離培養基試劑、生化試驗試劑和鑒定血清試劑。
1.3 儀器 生化培養箱、冰箱、顯微鏡。
1.4 方法 《全國臨床檢驗操作規程》（第2版）-1997;《食品衛生微生物學檢驗》GB/T4789.1～31-2003;《傳染病診斷標準及相關法規匯編》-2003。
2 檢測思路和檢測結果
2.1 樣品來源及樣品性狀廣東省疾病預防控製中心提供的微生物實驗室間比對項目的3號項目樣品，是從1例急性腸道傳染病病人糞便中分離出的腸道致病菌培養物，屬需氧或兼性厭氧菌。該樣品為子彈管裝凍幹粉劑菌株，樣品運送溫度為常溫。
2.2 檢測思路 從已知條件來看，從需氧狀況看，該菌株屬需氧或兼性厭氧菌可以排除厭氧菌;運送溫度為常溫，說明該菌株是中溫菌，可以排除嗜冷菌、嗜熱菌;該菌株來源於1例急性腸道傳染病人的糞便，說明該菌株為腸道菌，而且是致病菌，可引起急性致病，可以排除腸道正常菌群和腸道條件致病菌。根據《全國臨床檢驗操作規程》（第2版）-1997提供的糞便標本中常見的病原菌種類，不是厭氧菌的革蘭陽性菌有:金黃色葡萄球菌、結核分枝杆菌、白色念珠菌;革蘭陰性菌有傷寒及其它沙門菌、誌賀菌、致病大腸埃希菌、弧菌屬菌種、氣單胞菌種、鄰單胞菌、小腸結腸炎耶爾森菌、彎曲菌。鑒定時可以將範圍縮至這11種菌，培養基可以選擇這11種菌的增菌培養基和分離培養基。在選擇增菌培養基和分離培養基時，要充分考慮各種類型的常用培養基和專用培養基。
2.3 培養、觀察和鑒定
2.3.1 複蘇培養 由於該樣品為子彈管裝凍幹粉劑菌株，無法直接塗片鏡檢，必須進行複蘇培養。用接種環挑取凍幹粉劑菌株分別接種於營養肉湯中，36℃分別培養6h;接種於加有血清的布氏肉湯中，43℃微需氧培養8h。
2.3.2 接種 挑取—接種環於營養肉湯分別直接劃線接種於一塊普通瓊脂平板和一塊血瓊脂平板中，36℃培養24h。同時接種普通瓊脂平板和血瓊脂平板，除可以觀察菌落形態特征外，還可以互相對比觀察該菌的營養要求、色素及溶血性等。
2.3.3 增菌培養 吸取生長良好的營養肉湯培養物0.5ml接種於下列增菌液:堿腖水、SC增菌液、GN增菌液、腸道菌增菌肉湯、氯化鈉結晶紫增菌液、7.5%氯化鈉肉湯、改良PBS。其中GN增菌液36℃培養6h、堿腖水36℃培養8h，改良PBS4℃培養1天、3周，其它增菌液36℃培養24h。吸取加有血清的布氏肉湯培養物0.5ml接種於CEM增菌液，43℃微需氧培養48h。
2.3.4 分離培養 將上述增菌液分別接種於下列平板培養。（1）堿腖水-四號瓊脂平板和TCBS平板，36℃培養24h。（2）SC增菌液-SS平板和EMB平板，36℃培養24h。（3）GN增菌液-SS平板和EMB平板，36℃培養24h。（4）腸道菌增菌肉湯-SS平板、HE平板、麥康凱平板和EMB平板，36℃培養24h。（5）氯化鈉結晶紫增菌液-TCBS平板，36℃培養24h。（6）7.5%氯化鈉肉湯-血瓊脂平板，36℃培養24h。（7）改良PBS-NYE平板和麥康凱平板，分別在22℃和36℃培養48h。（8）CEM增菌液-Camp-BAP血瓊脂平板、Skirrow血瓊脂平板，43℃微需氧培養48h。
2.3.5 菌落形態觀察 （1）普通瓊脂平板36℃培養24h後平板上生長形成中等大小、無色透明、濕潤、邊緣整齊、表麵光滑、稍呈隆起的菌落，菌落形態一致。（2）血瓊脂平板36℃培養24h後平板上生長形成中等大小、白色、濕潤、邊緣整齊、表麵光滑、稍呈隆起的菌落，菌落形態一致。（3）SS平板、麥康凱平板和EMB平板36℃培養24h後平板上分別生長形成中等大小、無色透明、濕潤、邊緣整齊、表麵光滑、稍呈隆起的菌落，菌落形態一致。（4）HE平板36℃培養24h後平板上生長形成中等大小、綠色透明、濕潤、邊緣整齊、表麵光滑、稍呈隆起的菌落，菌落形態一致。（5）SS平板、麥康凱平板和EMB平板在36℃培養48h後菌落發生變化:SS平板、EMB平板的菌落變粉紅色;麥康凱平板上的菌落變灰白色，並形成粗糙形菌落。
2.3.6 染色鏡檢 各挑取普通瓊脂平板、血平板、SS平板、HE平板、麥康凱平板和EMB平板上單個菌落，染色鏡檢，發現革蘭陰性的短小杆菌，菌體形態一致。
2.3.7 純培養及初步生化試驗 挑取各平板上的單個菌落接種於三糖鐵瓊脂和葡萄糖半固體，36℃培養24h。每個平板挑取5個菌落分別接種5支三糖鐵瓊脂、挑取5個菌落分別接種五支葡萄糖半固體，防止漏檢。觀察可見所有三糖鐵瓊脂培養物均發酵葡萄糖、產酸不產氣，不發酵乳糖、蔗糖;所有葡萄糖半固體培養物發酵葡萄糖、產酸不產氣、沿穿刺線生長、無動力。
2.3.8 氧化酶試驗 挑取各平板培養物、三糖鐵培養基培養物做氧化酶試驗:均為陰性。
2.3.9 血清學分型 根據該菌的培養特性、營養要求、菌落形態和菌體形態特征及初步生化試驗、氧化酶試驗結果，挑取三糖鐵瓊脂上的培養物，做下列玻片凝集試驗，觀察結果。
誌賀菌4種多價診斷血清:凝集;宋內誌賀菌血清:凝集;宋內誌賀菌Ⅰ相血清:凝集。其中有1支從GN增菌液分離到SS平板再接種到三糖鐵瓊脂上的三糖鐵瓊脂培養物，誌賀菌4種多價診斷血清不凝集;將菌液煮沸後再做玻片凝集試驗，仍然不凝集;用鮑氏多價1、2、3分別檢查，也不凝集;用痢疾誌賀菌3～12型多價血清檢查，也不凝集;將此三糖鐵瓊脂培養物進行傳代培養後，再做玻片凝集試驗。誌賀菌4種多價診斷血清:凝集;福氏誌賀菌多價血清:凝集;福氏誌賀菌2型血清:凝集;福氏誌賀菌群3，4因子血清:凝集;
2.3.10 進一步生化反應 誌賀菌屬血清凝集的細菌，還需用生化試驗進一步確認，防止診斷血清出現假陽性反應。
2.3.10.1 挑取三糖鐵培養基培養物進行下列生化試驗，觀察結果。
表1 宋內誌賀菌Ⅰ相血清凝集的三糖鐵瓊脂培養物生化試驗（略）
注:“+”為陽性;“-”為陰性
表2 福氏誌賀菌2型血清、群3，4因子血清凝集的三糖鐵瓊脂培養物生化試驗（略）
注:“+”為陽性;“-”為陰性
2.3.10.2 挑取三糖鐵培養基培養物進行下列生化分群試驗，觀察結果。
表3 宋內誌賀菌Ⅰ相血清凝集的三糖鐵瓊脂培養物生化試驗（略）
注:“+”為陽性;“-”為陰性
表4 福氏誌賀菌2型血清、群3，4因子血清凝集的三糖鐵瓊脂培養物生化試驗（（略）
注:“+”為陽性;“-”為陰性
2.3.11 鑒定結果 檢出宋內誌賀菌Ⅰ相和福氏誌賀菌2a型。
3 討論
3.1 對未知菌株的鑒定，一般可以采用下列順序直接塗片鏡檢、增菌培養、分離培養、菌落和菌體觀察、純培養、生化反應試驗和血清學鑒定、藥物敏感性試驗和動物實驗。藥物敏感性實驗和動物實驗按菌株鑒定要求做。本例比對考核由於該樣品為凍幹粉劑菌株，無法直接塗片鏡檢，必須先進行複蘇培養、增菌培養、接種平板後才能鏡檢。
3.2 鑒定菌株的首要條件是將菌株進行純培養對分離培養物進行菌落觀察和鏡檢觀察菌體形態，隻有菌落形態和菌體形態都一致時，才能進行純培養和鑒定，否則還須繼續分純。挑取菌落形態和菌體形態都一致的可疑菌落進行純培養，然後再對純菌株進行一係列的鑒定。進行純培養時，當需要細菌數量較多時，應用分離平板進行純培養;若隻需少量細菌，可用三糖鐵瓊脂進行純培養，並可同時觀察初步生化反應。由於某些菌屬之間或同菌屬不同菌型的細菌之間的菌落形態及菌體形態相似，進行純培養時，應在同一平板上多挑幾個單個菌落進行純培養，防止不同菌屬之間或同菌屬不同菌型的細菌之間出現漏檢。
3.3 有條件的單位可以使用自動化鑒定係統［4］ 既可以大大縮短檢驗時間又可以節省大量的工作量。自動化鑒定雖然還不是國家標準方法，但其結果可以作為未知菌株鑒定的參考。
3.4 質量控製 整個檢驗過程注意無菌操作，使用空白對照，陰、陽性對照，可以保證試驗的成功;染色液、培養基、試劑、診斷血清等要在有效期內使用，並且要用已知參考菌株進行測試;選用合適的鑒定係統，並將分離菌株與相關的參考菌進行比較，可以有效保證實際應用鑒定係統。
作者：李義強 中華醫藥雜誌 2005年8月 第5卷 第8期
【參考文獻】
1 中華人民共和國衛生部醫政司.微生物學檢驗，全國臨床檢驗操作規程，第2版.1997，437-576.
2 中華人民共和國衛生部，中國國家標準化管理委員會.中華人民共和國國家標準，食品衛生微生物學檢驗，2003，1-249.
3 衛生部衛生監督中心衛生標準處.傳染病診斷標準及相關法規匯編，2003，53-305.
4 東秀珠，蔡妙英.常見細菌係統鑒定手冊，北京:人民衛生出版社，2001，57.
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