簡化的兩步法細菌內同源重組腺病毒表達載體重組高效製備p53基因

【摘要】  目的  應用細菌內同源重組高效製備p53基因重組腺病毒。方法  設計引物擴增p53基因，在上下遊引物分別引入Xhol和HindⅢ酶切位點，將p53基因亞克隆連接到經相同酶切的p shuttle-cmv轉移質粒上，轉化DH5α篩選卡那黴素抗性菌落構建重組腺病毒轉移質粒p shuttle-cmv-p53用Pmel酶切線性化采用兩步法進行同源重組：先將腺病毒骨架質料pAdEasy-1轉化氯化鈣法製備的BJ5183感受態細菌，篩選得到鏈黴素和氨苄青黴素抗性的AdBJ5183轉化菌；再將線性化的p shuttle-cmv-p53轉化氯化鈣法製備的AdBJ5183感受態細菌，在細菌內進行同源重組，挑選卡那黴素抗性菌落培養並提取質粒，瓊脂糖電泳挑選大片斷的重組質粒pAdBJ5183-P53分別用限製性內切酶PacI和BstXI及PCR法鑒定。結果  成功構建了p53基因重組腺病毒表達載體。結論  采用簡化的兩步氯化鈣化學轉化法可以取代電穿孔法高效構建重組腺病毒表達載體。

   

    【關鍵詞】  腺病毒載體；同源重組；p53基因

   

    Construction of recombinant adenoviral vector carrying wt-p53 gene by simplified two-step homologous recombination in bacteria

   

    ZOU Chang-yong，QUANG Jia-wu，TIAN Sheng-he，et al.Wuhan Institute of Biological Products，Wuhan 430060，China

   

    【Abstract】  Objective  To construct recombinant replication-defective human adenovirus serotype 5 vector carrying wt-p53 gene by simplified two-step homologous recombination protocol in bacteria.Methods  wt-p53 gene was firstly subcloned into a transfer vector p shuttle-cmv and the positive recombinant p shuttle-p53 was linearized by PmeI.Then the simplified two-step homologous recombination protocol was employed for the construction of recombinant adenoviral vector.In step one，adenoviral skeletal plasmid pAdeasy-1 was transformed into BJ5183 competent cells by calcium chloride chemical methed to obtain pAdBJ5183;and in step two，linearized psh-p53 plasmid was transformed into pAdBJ5183.The possible positive adenoviral plasmids were selected by agarose gel electrophoresis and indentified by PacI as well as BxtXI cleaved pattern.Results  Replication-defective recombinatant adenovirus containing human p53 gene was successfully constructed.Conclusion  The results indicated that the calcium chloride chemically simplified two-step homologous recombination protocol can replace the co-transformation by electroperforation and may have broaed utility in system that involve homologous recombination in bacteria.

   

    【Key words】  adenoviral vector;homologous reombination;p53 gene

   

    複製缺陷型腺病毒可以高效介導基因的體內外轉移；感染細胞範圍廣，不但可以感染分裂期細胞，也可感染靜止期細胞；感染細胞時其DNA不整合到宿主細胞染色體中，安全可靠。因此成為基因治療中常用的載體。重組腺病毒載體的構建方法有真核細胞內質粒重組法、酵母人工染色體克隆係統、Cre/loxp定點重組係統、末端蛋白-DNA複合物共轉染法等［１～３］。以上方法牽涉到的步驟和環節較多、工作量大、實驗周期長。1998年He等［4］建立了細菌內質粒共轉化同源重組方法，該法簡便快速、實驗周期短，但是共轉化需要電穿孔儀，且同源重組成功率不到20%。筆者在實際工作中對該法進行了改進，采用簡化的兩步氯化鈣化學轉化法代替電穿孔共轉化法構建了p53重組腺病毒表達載體。

   

    1  材料與方法

   

    1.1  實驗材料  pAdEasy-1、pshuttle-cmv質粒，BJ5183、

   

    DH5α大腸杆菌，PmeI酶購自Qbiogene公司；攜帶p53基因的質粒由馬延高教授惠贈；PacI酶購自New England公司；PCR Premix、DL2000Marker購自TaKaPa公司；λDNA·HindⅢMarker購自Promega公司；其他分子生物學工具酶購自MBI公司。

   

    1.2  重組轉移質粒的構建  設計擴增p53基因的上下遊引物分別為：

   

    p53-up:5 atg tct cga gat gga gga gcc gca gtc aga 3 （30bp），

   

    p53-down:5 aag taa gct ttc agt ctg agt cag gcc ctt 3 （30bp），在上下遊引物分別引入XhoI和HindⅢ酶切位點，由上海生工合成。采用上述引物以攜帶p53基因的質粒為模板進行PCR擴增p53基因片斷。PCR參數為：94℃變性5min;94℃30s、56℃30s、72℃50s，共30個循環；72℃延伸10min。用XhoI和HindⅢ酶切PCR產物，瓊脂糖凝膠電泳回收，連接到同樣經XhoI和HindⅢ酶切回收的pshuttle-cmv轉移質粒中；轉化DH5α感受態菌，卡那黴素抗性平板篩選。

   

    1.3  重組轉移質粒的鑒定  挑選卡那黴素抗性平板篩選菌落培養，堿裂解法提取質粒，用XhoI和HindⅢ酶切鑒定，並以能酶切出與目的基因片段大小相符的質粒為模板，用上述引物進行PCR鑒定。得到的重組轉移質粒命名為psh-p53。再用上述引物由上海生工公司測定psh-p53中目的基因片段序列。

   

    1.4  兩步法細菌內同源重組產生重組腺病毒質粒

   

    1.4.1  step1:用氯化鈣法製備BJ5183感受態細菌  將腺病毒骨架質粒pAdEasy-1轉化BJ5183感受態細菌，接種在鏈黴素和氨苄青黴素抗性平板篩選，挑取菌落培養並抽提質粒，以pAdEasy-1為對照，用BstXI酶切鑒定，得到的陽性菌命名為AdBJ5183菌。

   

    1.4.2  step2:同源重組  用氯化鈣製備AdBJ5183感受態細菌；將序列正確的重組轉移質粒psh-p53用PmeI酶切線性化，不需滅活PmeI酶，也不需回收，直接取大約30ng酶切線性化質粒轉化AdBJ5183感受態細菌，卡那黴素抗性平板篩選，挑取菌落培養並抽提質粒，0.8%瓊脂糖電泳初篩分子量大於30kbp的質粒，以pAdEasy-1為對照，分別用PacI、BstXI酶切鑒定，對酶切圖譜符合的質粒采用前述擴增目的的基因片段的引物進行PCR鑒定。得到的陽性菌命名為AdBJ5183-p53菌。相應的陽性重組腺病毒質粒為pAdBJ5183-p53。再將AdBJ5183P53轉化DH5α得到pAdp53。

   

    2  結果

   

    2.1  重組轉移質粒psh-P53的構建及鑒定

   

    （1）重組轉移質粒psh-P53經XhoI和HindⅢ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，出現一條約7.4kg的轉移質粒帶和一條約1.2kb的p53目的基因帶，見圖1。

   

    （2）以能酶切出與目的基因片段大小相符的質粒為模板，用擴增目的基因的引物進行PCR鑒定。可以得到約1.2kb大小的片斷，見圖2。

 

圖1  重組轉移質粒的酶切鑒定

Fig1  screening recombinant transfer vecter by XhoI and HindⅢ   lanel:DL2000Marker lane2～4：recombinant transfer vecter/XhoI and HindⅢ lane5～6：transfer vector/XhoI and HindⅢ as control

 

圖2  重組轉移質粒的PCR鑒定

Fiv2  screening recombinant transfer vecter by PCR lane1:negative control    lane2:positive control lane3:recombinant transfer vecter lane4:DL2000 marker

 

    （3）測序結果經Vector NTI軟件分析正確。

    

    2.2  重組腺病毒表達質粒的構建及鑒定

   

    （1）將腺病毒骨架質粒轉化BJ5183感受態菌，抽提鏈黴素和氨苄青黴素雙抗性的質粒，對照骨架質粒pAdEasy-1，用BstXI酶切鑒定。pAdEasy-1質粒有6個BstXI酶切位點，可以產生6個片斷。電泳結果顯示，AdBJ5183質粒與pAdEasy-1圖譜一致，見圖3。

 

圖3  pAdBJ5183質粒用BstXI酶切鑒定

padBJ5183 plasmids cleaved pattern by BstXI lane1:λDNA/HindⅢ Marker，lane2:pAdEasy-1，lane3:pAdEasy-1/BstXI，lane4:pAdBJ5183/BstXI

 

    （2）線性化的重組轉移質粒psh-p53轉化AdBJ5183感受態細菌進行同源重組後，抽提卡那黴素抗性的質粒，0.8%脂糖電泳發現有2種質粒：其一分子量約34kb，為可能的重組腺病毒質粒；另一分子量約9kb，為重組轉移質粒psh-p53。可以很直觀方便地初篩出可能的大片斷重組腺病毒質粒（圖略）。

       

    PacI酶切分子量約34kb的質粒可出現一條約30～35kb的大片斷和一條4.5kb的特征性片斷見圖4。與預期結果相符。

   

    BstXI酶切鑒定重組腺病毒質粒 PAdEasy-1質粒有6個BstXI酶切位點，可以產生6個片斷，依次為11921bp、8237bp、5251bp、4254bp、2379bp、1399bp。其與線性化的psh-p53在BJ5183中發生同源重組的位置隻引起片斷2的改變。本實驗采用Pshuttle-cmv為轉移質粒，同源重組後片斷2將漂移至11～12kb左右，與片斷1重疊，隻可以觀察到5條帶。與預期結果相符。結果見圖5。

 

圖4  重組腺病毒質粒PAdBJ5183 p53用pacI酶切鑒定

Fig4:Identification of recombinant Adenoviral plasmids by PacI lane1:λDNA/HindⅢ　Marker，lane2:PAdeasy-1/PacI，lane3-6:pAdBJ5183-p53/PacI

 

圖5重組腺病毒質粒PAdBJ5183 p53用BstXI酶切鑒定

Fig5  Identification of recombinant Adenoviral plasmids by BstXI cleaven patten

lane1:λDNA/HindⅢ Marker，lane2～4：pAdBJ5183-p53/BstXI；

lane5:PAdeasy-1/BstXI；lane:PAdeasy-1

 

    以酶切鑒定正確的重組腺病毒質粒為模板進行PCR，可擴增出與目的基因大小相符合的片斷，見圖6。

 

圖6  重組腺病毒質粒的PCR鑒定

Fig6  PCR amplified p53 gene of recombinant Adeneviral plasmids lane1:DL2000 marker；lane2-6:pAdBJ5183;lane7:psh-p53 positive control;lane8:negative control

 

    3  討論

   

    傳統的構建重組腺病毒的方法是在293細胞內進行質粒間同源重組，這些方法存在細胞類同源重組效率低、實驗周期長等缺點，給研究工作帶來了諸多不便；利用生長周期快、操作方便的大腸杆菌實現質粒間同源重組產生腺病毒的方法具有重組效率高、病毒基因組高度一致、不需蝕斑純

   

    化篩選純係病毒等優點。在進行細菌內同源重組時，最初的方法是將腺病毒骨架質粒和線性化的重組轉移質粒電穿孔共轉化大腸杆菌BJ5183，這種方法需要電穿孔儀，而且重組效率相對較低；Zeng等［5］采用兩步法進行了改進，先用電穿孔法將骨架質粒PAdEasy-1轉化電穿孔感受態大腸杆菌BJ5183，得到BJ5183AdEasy，再將線性化的重組轉移質粒電穿孔法轉化電穿孔感受態大腸杆菌BJ5183AdEasy進行同源重組，由於該法是將轉移質粒轉化到已攜帶有骨架質粒的繁殖能力強的BJ5183菌中，避免了將轉移質粒轉化到有缺陷或複製能力弱的細菌中，因而成功率提高到94%（16/17），但該法仍然需要電穿孔儀，一般實驗室難以推廣。筆者將該兩步法的電穿孔部分改為傳統的氯化鈣化學轉化法，而且線性化的重組轉移質粒不需經過熱滅活PmeI酶及凝膠電泳回收，直接用於轉化，也得到了較高的重組率（6/8）。本研究正在進行p53基因重組腺病毒生物學特性的研究及對腫瘤細胞作用的研究。

作者：鄒昌勇，全家嫵，田生和，楊京生，吳季南  中華醫藥雜誌 

作者單位： 430060 湖北武漢，武漢生物製品研究所

【參考文獻】

 

    1  顧建人，曹雪濤.基因治療.北京：科學出版社.2001，197.

    2  Ng P，Parks RJ，Cummings DT，et al.A high-efficiency Cre/loxP-based system for constrction of adenoviral vectors.Hum Gene Ther，10:2667-2672.

    3  Kamen A，Henry 0.Development and optimization of an adenovirus production process.J Gene Med，2004，6:184-192.

    4  He TC，Zhou S，L.T.da Costa，et al.Asimplified system for generating recombinant adenovirus.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（5）:2509-2514.

5  Zeng M，Smith SK，Siegel F，et al.AdEasy system made easier by selecting the viral backbone plasmid preceding homologous recombinanation.Bio Techniques，2001，13（2）:260-262.