金黃色葡萄球菌耐藥性研究進展

摘  要

       金黃色葡萄球菌廣泛分布於自然界，在空氣、土壤和水中廣泛存在，在人體皮膚毛囊、皮脂腺管、鼻腔和腸道中也常有本菌存在。醫院的醫師和護士中鼻腔帶菌達到80～100%，而且常為耐藥菌株，是醫院感染的重要因素[1]。

  Resistance of Staphylococcus Aureus

　　金黃色葡萄球菌廣泛分布於自然界，在空氣、土壤和水中廣泛存在，在人體皮膚毛囊、皮脂腺管、鼻腔和腸道中也常有本菌存在。醫院的醫師和護士中鼻腔帶菌達到80～100%，而且常為耐藥菌株，是醫院感染的重要因素[1]。金黃色葡萄球菌之所以成為醫院感染的致病菌是因為其很容易獲得抗生素耐藥性。金黃色葡萄球菌對青黴素耐藥出現於1994年，僅僅在青黴素使用2年後； 而對甲氧西林耐藥出現於1961年，即耐酶青黴素使用1年以後； 萬古黴素是治療MRSA的首選藥物，然而1996年日本發現萬古黴素中介的金黃色葡萄球菌(VISA)，2002年和2004年美國又相繼報道[2]3例萬古黴素高度耐藥的金黃色葡萄球菌(VRSA)。萬古黴素耐藥金黃色葡萄球菌的出現使細菌感染再次成為非常棘手的臨床問題，2003年美國CDC製定了“VRSA/VISA檢測和控製指南”，2005年NCCLS藥敏試驗執行標準中增加了萬古黴素耐藥金黃色葡萄球菌檢測方法，要求各實驗室開展對萬古黴素耐藥菌的監測。

　　一、金葡菌主要耐藥類型和耐藥機製

 

1. 青黴素耐藥金黃色葡萄球菌

 

產生b-內酰胺酶，水解青黴素中有效基團。

 

2. 甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌

 

獲得MecA基團，編碼產生PBP2a，對b-內酰胺類抗生素敏感性減低。

 

3. 萬古黴素耐藥的金黃色葡萄球菌

 

獲得萬古黴素耐藥腸球菌(VRE)的耐藥基因，使萬古黴素失去作用位點；或是細胞壁增厚，使萬古黴素不能到達作用靶位。

　　二、MRSA耐藥性研究進展

 

1. MRSA的耐藥機製

 

在萬古黴素敏感的金黃色葡萄球菌(MSSA)中含有5種與b-內酰胺類抗生素親和力高的青黴素結合蛋白(PBP)，即PBP1、PBP2、PBP3、PBP3’和PBP4，總稱為PBPs，PBPs具有羧肽酶或轉肽酶作用，主要參與細胞壁粘肽層的合成，對於細菌生長繁殖、保持正常形態起重要的作用，是細菌生長、繁殖所必需的。MSSA中PBPs和b-內酰胺類抗生素結合後，酶功能被抑製，使細胞壁合成受阻，導致細菌因不能抵抗外界的滲透壓力而死亡。MSSA活動一個耐藥基因(mecA)後，即為MRSA。mecA能編碼合成一種新的青黴素結合蛋白2a(PBP2a)，PBP2a能執行PBPs的生理功能，但與b-內酰胺類抗生素親和力低，當有b-內酰胺類抗生素存在時，正常的PBPs與之結合，功能被抑製，而PBP2a不與之結合，則可代替PBPs發揮作用，使細菌能夠正常生長，產生耐藥性。MecA基因可以在葡萄球菌屬間轉移和傳遞，但mecA的起源目前尚不清楚，有研究發現[3]鬆鼠葡萄球菌的PBP與MRSA的PBP2a有87.8%的氨基酸同源性，推測可能是PBP2a的前體。而在葡萄球菌屬以外的其他細菌屬中並未發現有mecA的存在。

2. MRSA基因分型及其意義

 

編碼PBP2a的mecA基因不是MRSA菌株所固有的，而是一個外來的插入片段，該片段以基因複合體的形式存在，攜帶mec基因盒(stphylocossal cassette chromosome mec , SCC-mec),SCCmec 基因盒包括兩種基因複合體:

 

⑴mec基因複合體: 由編碼 PBP2a的結構基因 (mecA)和位於其上遊的調節基因(mecR1)和抑製基因(mecI)組成，三者控製著MRSA耐藥性的表達程度，其中mecA是耐藥性表達的結構基礎。在通常情況下，mecI編碼的抑製因子(mecI蛋白)結合在mecA基因的啟動子部位，使mecA基因不能被轉錄； mecR1在誘導劑(如b-內酰胺類抗生素)的作用下編碼產生誘導因子 (mecR1蛋白)，能夠去除 mecI蛋白對mecA的阻遏作用，使mecA轉錄產生 PBP2a。在MRSA中mecR1和 mecI可以是完整的，也可能是不完整的。根據 mec基因複合體結構，可分為4型，常見的是A和B型，結構特征為，A型:  IS431-mecA-mecR1-mecI； B型: IS431-mecA-mecR1-IS1272 。在mec基因複合體中，IS431的存在有吸引其他耐藥基因的功能，使之整合到 SCCmec中，因此MRSA不但對b-內酰胺類抗生素耐藥，對其他抗生素也存在抗藥性，IS431插入子是染色體內多重耐藥基因存放的位點。

 

⑵染色體盒重組基因複合體(cassette chromosome recombinases, ccr)，有兩種點特異性重組基因組成，ccrA和ccrB，負責SCCmec基因盒的移動，ccrA和ccrB可分為1、2、3型。

 

根據mec和ccr基因複合體結構，可將SCCmec基因盒分為四型。

 

I型: 由B型mec基因複合體和ccr1型基因複合體組成。多見於早期分離的MRSA菌株，代表株為NCTC10442，是1961年首次從英國分離出的MRSA菌株[4]。在I型中除mecA基因外沒有其他耐藥基因。

 

II型: 由A型mec基因複合體和ccr2型基因複合體組成。是目前醫院感染MRSA中常見的基因型，代表株為N315，是1982年從日本分離的MRSA菌株[4]。在II型SCCmec的J區中含有完整的pUB110質粒和Tn554轉座子，Pub110與細菌對氨基糖苷類抗生素、卡那黴素、妥布黴素耐藥有關，Tn554編碼紅黴素、壯觀黴素抗藥性。

 

III型: 由A型mec基因複合體和ccr3型基因複合體組成。也是醫院感染MRSA常見的基因型，代表株85/2082，是1985年從新西蘭分離的MRSA菌株[4]。在Ⅲ型SCCmec中mecA以外，還含有完整的pT181質粒、Tn554轉座子和jTn554。jTn554是編碼抗鎘的基因，pT181質粒編碼四環素耐藥、Tn554編碼紅黴素、壯觀黴素抗藥性。

 

IV型: 由B型mec基因複合體和ccr2型基因複合體組成。是新出現的社區感染MRSA常見基因型，MW2和CA05為Iva 型代表菌株，8/6-3P為Ivb型代表菌株，在IVa 和IVb型SCCmec中除mecA外，不含其他耐藥基因。

 

3. 社區感染MRSA(CO—MRSA)

 

CO-MRSA是近年來出現的一種新的耐藥模式，在美國、澳大利亞和歐洲引起廣泛重視[5]。CO-MRSA多為IVa 或Ivb基因型，僅含mecA基因，與典型的醫院感染MRSA(H-MRSA)比較，主要的特征是僅表現為對b-內酰胺類抗生素耐藥，而對多種非b-內酰胺類抗生素(如慶大黴素)的敏感性可能增加，甚至僅對青黴素類耐藥，對頭孢類抗生素也表現為敏感。與H-MRSA比較CO-MRSA的毒性更強，可產生殺白細胞毒素。較多的研究認為，CO-MRSA並非其源於H-MRSA，而是一種新的耐藥模式。

　　三、萬古黴素耐藥金葡菌研究進展

 

1. 概述

 

萬古黴素金黃色葡萄球菌一般分為三種: 萬古黴素耐藥金黃色葡萄球菌(Vancomycin-Resistant Staphylococcus Aureus, VRSA)、萬古黴素中度耐藥金黃色葡萄球菌(Vancomycin-intermediate Staphylococcus Aureus, VRSA)和萬古黴素異源性耐藥金黃色葡萄球菌(Heterogeneous  Vancomycin-Resistant Staphylococcus Aureus, Hetero-VRSA)。VRSA是指臨床分離的金黃色葡萄球菌(簡稱金葡菌)對萬古黴素的MIC≥32mg/l，於2002年在美國首次報道[6]，至今在全世界僅報道三例。VISA指金葡菌對萬古黴素的MIC為8～16mg/l ，於1997年由日本學者首先分離出第一株對萬古黴素中度耐藥的金黃色葡萄球菌(Mu50，MIC=8 mg/l)，隨後美國和中國等地又陸續發現多株VISA。hetero-VRSA指從臨床標本分離的金葡菌原代純培養物，萬古黴素的MIC≤32mg/l ，但在萬古黴素敏感的原代中，存在有部分對較高濃度萬古黴素耐藥的亞群，這些耐藥亞群可以通過一定方法從原代菌株中檢測出來，對選擇出的耐藥亞群做萬古黴素MIC測定，濃度可以增加2～8倍。1996年日本首先分離出hetero-VRSA(Mu3，MIC=3mg/l)，此後許多國家相繼有報道。

2. 耐藥機製

 

(1)耐藥質粒傳遞1992年，Noble成功地將糞腸球菌耐藥質粒傳遞給金葡菌，在實驗室內構建成“VRSA”。美國於2002、2004年共分離出3株VRSA，均檢測出與萬古黴素耐藥腸球菌(VRE)一致的VanA基因。金葡菌分泌一種肽，其活性類似於糞腸球菌的性信息素CAM373。Sasha等發現攜帶有VanA基因的糞腸球菌對這種肽產生反應，通過信息素相關過程把其耐藥質粒轉移至金葡菌體內。經這種機製獲得的耐藥，一般呈高水平，MIC值可達到1024mg/l 。

 

2003年Weigel等報道了[7]美國Michigan州一位糖尿病患者足部分離的VRSA基因分析結果，證實其耐藥基因來源於共同分離的糞腸球菌，它為VanA基因組所編碼，存在於一個 57.9-Kb的多耐藥性質粒中，該質粒含有完整的10.8-Kb的Tn1546轉座子，Tn1546編碼9個多肽，這9個多肽協同作用最終形成D-丙氨酰-D-乳酸，取代了細菌肽聚糖前體中的UDP-胞壁酸五肽的 D-丙胺酰-D-丙氨酸，取消了肽聚糖前體與萬古黴素之間原有的氫鍵結合，並使原來的空間構象發生改變，使萬古黴素失去作用位點，導致金葡菌對萬古黴素高水平耐藥。

 

(2)染色體突變

 

VISA和hetero-VRSA菌株的大量研究中並沒有發現VanA， VanB或VanC基因。但是，日本學者認為[8]以克隆型IIA為代表的MRSA比世界其他地區的金葡菌更容易產生對萬古黴素耐藥的潛能。George等[8]測定了6株分離於美國的VISA，發現他們都屬於附屬基因調節子II族(Accessory Gene Regulator II，agrII)，並且發現從血液中分離出的MRSA中有56%屬於agrII族(n=148)，而僅有24%甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)屬於agrII族(n=33)，大量基因分析證實了agr基因點突變引起的功能喪失，更易使agrII型金葡菌發展為hetero-VRSA，故認為hetero-VRSA的產生可能與agrII型功能喪失有關。Wooton等[8]最近比較了10株臨床分離的VISA(包括Mu50)，11株hetero-VRSA(包括Mu3)和11株萬古黴素敏感的金黃色葡萄球菌(Vancomycin-Sensitive Staphylococcus Aureus ，VSSA)的17個開放讀碼框: murA、metB、yibM、atl、opuD、lysP、mutS、uhpT、modA、glpT、odhA、sdh、mrp-homologue、SA2468和ribH。發現Mu50、Mu3和其他VISA、hetero-VRSA菌株中均有不同程度的基因突變，但沒有固定的突變位點。故認為金葡菌對萬古黴素產生耐藥是細菌在抗生素選擇壓力的不斷作用下發生突變所致，該突變不穩定是涉及染色體上多位點的一個逐步逐漸過程，這種過程必須在抗生素持續存在的條件下才能繼續。

 

(3)細胞壁增厚

 

Daum在1992年[9]報道了一株在實驗室通過耐藥平板誘導而對萬古黴素敏感性降低的金葡菌，這株金葡菌細胞壁增厚，對溶菌酶敏感性減低，也喪失了噬菌體和莢膜(capsular)分型。日本學者Cui 用透射電鏡技術對自7個國家分離的16株VISA進行觀察，發現VISA細胞壁平均厚度為31.3nm，而萬古黴素敏感菌株VSSA細胞壁的厚度僅為23.4 nm，二者間存在著顯著差異。Cui進一步發現: 當VISA對萬古黴素恢複敏感後(MIC＜4 mg/l)，它們細胞壁的厚度降低且與VSSA無區別。再用萬古黴素對這些恢複敏感性的菌株進行選擇，細菌對萬古黴素的耐藥性又回複至原先水平，同時出現細胞壁的增厚。表明細胞壁增厚是VISA和hetero-VRSA的共同特征，與細菌對萬古黴素的MIC水平存在明顯的相關性(r=0.908)。Cui認為VISA的細胞壁增厚主要是因為肽聚糖層數的增多，其數量可達到3040層。這種增厚可以通過二種機製，一是過多的肽聚糖的合成，二是減少肽聚糖的脫落。VSSA漿膜表麵新生的肽聚糖層取代舊的肽聚糖層，使舊肽聚糖層從細菌表麵脫落，而這一過程需要肽聚糖水解酶的參與。但研究發現VISA肽聚糖水解酶的活性顯著降低，而導致舊肽聚糖層脫落減少及細胞壁增厚。當其肽聚糖水解酶活性恢複正常時，細胞壁隨著變薄且對萬古黴素恢複敏感性。

 

細胞壁增厚導致金葡菌對糖肽類抗生素耐藥，目前認為有兩種可能的機製。一種即“親和誘捕”，認為增厚細胞壁的肽聚糖層上有大量D-丙胺酰-D-丙氨酸殘基，它們可與萬古黴素結合，導致大部分藥物分子結合在細胞壁肽聚糖外層上，而不能接觸肽聚糖合成活性部位，因此細菌不能有效被殺滅。另一種是“阻塞現象”，認為糖肽類抗生素分子首先與細菌表麵肽聚糖層上的D-丙胺酰-D-丙氨酸殘基結合，阻塞了肽聚糖層的網眼，破壞其網狀結構，進而阻止藥物向細胞內滲及結合靶位點。上述兩種作用機製可單獨存在，也可同時起作用。有研究表明，Mu50純化的每單位重量肽聚糖中，D-丙胺酰-D-丙氨酸殘基的含量大約是VSSA株的2.4 倍，細胞壁厚度是VSSA的1.5倍，結合的萬古黴素分子是VSSA的3.6 倍。

 (4)糖肽鏈間交聯減少

 

肽聚糖交聯減少是金葡菌對萬古黴素耐藥機製之一。研究發現肽聚糖單體五肽支鏈上的穀氨酸殘基未被酰胺化是導致肽聚糖鏈間交聯減少的主要原因。金葡菌合成肽聚糖有二種途徑: 第一種途徑以N-乙酰葡糖胺為原料，另一種以葡萄糖為原料。研究發現[10]在VISA中第一種合成途徑較VSSA並無差別，而第二種途徑卻顯著增強。在該途徑中，金葡菌攝取環境中的葡萄糖並將其轉化為6-磷酸果糖，L-穀氨酰胺-6-磷酸果糖轉氨酶(Glms)又將6-磷酸果糖轉變為6-磷酸葡糖胺過程中十分關鍵，因為它能提供必需的NH4+。在VISA內，Glms活性較VSSA顯著增強，過度消耗了穀氨酰胺，導致肽聚糖單體五肽支鏈上的穀氨酸殘基不能酰胺化，無法為轉肽酶提供有效的底物，難以形成有效交聯。同時，異常增多的肽聚糖單體結合更多的萬古黴素分子，減少其進入漿膜的數量，進而使藥物分子不能接觸活性靶位。

 

轉肽酶是催化交聯形成的關鍵酶，其活性的改變也是肽聚糖鏈交聯減少的原因之一。但是單獨減少肽聚糖鏈交聯並不會導致耐藥，它必須和細胞壁增厚聯合作用時才發揮功效。此外，穀氨酸殘基非酰胺化肽聚糖上的D-丙胺酰-D-丙氨酸殘基對萬古黴素的親和力較酰胺化的強，這也有助於增加金葡菌的耐藥性。

 

(5)青黴素結合蛋白與其耐藥性的相關性

 

青黴素結合蛋白(penicillin-binding proteins , PBPs)是存在於細菌細胞內膜上一群能同青黴素和其他b-內酰胺類抗生素蟄合的細菌蛋白，即抗生素作用的靶位點。 Beatroz等[10]以實驗室誘導的VISA株為研究對象，就其PBP進行分析表明: 所有耐藥菌株PBP2結合青黴素的能力都明顯增強，PBP2產量增加，且PBP2產量增加與菌株對萬古黴素MIC增加呈正關係(r>0.9)，推測可能PBP2與萬古黴素競爭結合肽聚糖前體上的靶位，阻礙萬古黴素與靶位結合，導致敏感性下降。PBP4具有D-羧肽酶活性，可以從未形成交聯的細胞壁上切除D-丙氨酸殘基，避免過多的D-丙胺酰-D-丙氨酰五肽形成，從而保證萬古黴素有效地作用於金黃色葡萄球菌。Finan[11]等通過基因敲除及基因替補技術，發現在體外誘導產生的VISA中，PBP4活性較VSSA顯著減少，但二者的PBP4結構基因及側翼序列並無活性區別，推測可能與VISA在最低抑菌濃度的萬古黴素作用下編碼PBP4的質粒減少有關。研究證實: VSSA的PBP4編碼基因突變失活，導致VSSA對萬古黴素的敏感性下降且肽聚糖交聯減少； 補充編碼PBP4的質粒後，細菌的敏感性恢複且肽聚糖交聯增加。

 

3. 檢測方法

 

由於萬古黴素耐藥金黃色葡萄球菌感染的嚴重性，各國政府對此非常重視，2003年美國DCD製定了“VRSA/VISA檢測和控製指南”，2005年美國NCCLS文件的藥敏試驗執行標準中增加了VRSA/VISA的檢測方法和判斷標準:

 

(1)VRSA/VISA檢測方法:

 

①挑取菌落置肉湯或生理鹽水中，配製成0.5麥氏管濃度菌懸液，相當於1.5×108CFU/ml 。取10ul滴加於含6g/ml的萬古黴素腦心浸液培養基，用棉拭或接種環劃將其塗開成10～15mm直徑大小的區域； 每塊平板最多篩選8株細菌。

 

②使接種物被平板吸收，將平板置35℃空氣培養，過夜培養後觀察，若無細菌生長，則繼續培養，使培養時間滿24h。

 

③用反射光，仔細檢查是否有菌落或菌膜生長。

 

④如果在篩選培養基上有1個以上的菌落生長，則要確定接種物是否是金黃色葡萄球菌純培養菌株，並用非自動儀器法檢測MIC，可接受的檢測方法有: 瓊脂稀釋法、肉湯稀釋法、瓊脂梯度擴散法。對MIC≥4mg/l 的菌株要求通知當地CDC或衛生主管部門，同時保存菌種，並送CDC做最終確定。

 

⑤報告: 如果無菌落生長，報告萬古黴素敏感；有>1個菌落生長，報告為可能為VISA/VRSA菌株。

 

a. 初篩有>1個菌落生長: 報告為可能為VISA/VRSA菌株；

 

b. 用非自動儀器法檢測MIC≥4mg/l : 追加報告為金黃色葡萄球菌，VRSA(或VISA)；

 

c. 通知臨床醫師和感染科醫師和當地CDC或衛生主管部門。

 

⑥注意:

 

a. 每塊平板最多可篩選8株細菌，接種時應避免重疊；

 

b. 篩選培養基不能檢測金葡菌對萬古黴素的耐藥水平；

 

c. 革蘭陰性杆菌、VRE等也可在篩選培養基上生長，所以在篩選陽性的菌株應重新鑒定。

作者：蘇春康*  蘇振文*  吳泉明#   *福建省永定縣醫院檢驗科，福建 364100 #福建省臨床檢驗中心，福建 350007

 

 

參　考　文　獻

 

1. Hiramatsu K,Katayama Y,Yuzawa H,et al.Molecular genetics of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.Int J Med Microbiol,2002； 292(2):67-74.

2. Bo Shopsin,Barry N.Kreiswirth.Molecular epidemiology of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.Emerg Infect Dis,2001； 7(2):323-326.

3. Mark C.Enright D.Ashley Robinson,Gaynor Randle,Edward J.Feil,Hajo  Grundmann,and Brian G.Spratt The evolutionary history of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA).PNAS,2002； 99(11):7687-7692.

4. Nafsika H.Georgopapadakou.Infectious disease 2001:drug resistance,new drugs.Drug resistance updates,2002； 5:181-191.

5. Soju Chang,Dawn MS,Jeffrey C,et al.For the Vancomycin-Resistant Staphylococcus aureus Investigative Team.Infection with Vancomycin-Resistant Staphylococcus aureus containing the vanA Resistance Gene.New Engl J Med,2003； 348(14):1342-1347.

6. CDC Staphylococcus aureus resistant to vancomycin-United States,2002.MMWR Morb Mortal Wkly Rep,2002； 51(26):565-567.

7. Linares J.The VISA/GISA problem: therapeutic implications Clin Microbiol Infect,2001； 7(Suppl 4):8-15.

8. Lecaillon E,Gueudet P,Wooton M,et al.Endemic heteroresistant glycopeptide intermediate Staphylcoccus aureus (hGISA) comprising unrelated clonal types and not associated with vancomycin therapy.Pathol Biol (Paris),2002； 50(9):525-529.

9. CDC.PublicHealthDispatch:Vancomycin-resistant.Staphylococcus.aureus-Pennsylvania,2002； 51(40):902.

10. 何述祥.金黃色葡萄球菌耐藥性的變遷和耐藥機理.內蒙古醫學雜誌,2001； 33(4):342-345.

11. 馬越,陳鴻波,李景雲,等.1999～2000年北京和湖北地區金黃色葡萄球菌耐藥性分析.中國臨床藥理學雜誌,2002； 18(3):185-210