臨床標本的厭氧菌檢驗

厭氧菌檢驗是臨床微生物檢驗的重要組成部分。在無氧(或少氧)條件下，或氧化還原電勢低的條件下才能繁殖的細菌稱為厭氧菌。

 

　　因為厭氧菌在人體腸道、口腔、泌尿生殖道正常菌群中占優勢，所以當人體菌群失調時，厭氧菌可能侵犯人體許多部位，發生嚴重的甚至致死的內源性厭氧菌感染。厭氧菌感染常發生在深部傷口，但也可伴兼性厭氧菌和需氧菌侵犯人體任何器官和組織，根據文獻統計深部感染約一半以上有厭氧菌參與。所以，對厭氧菌檢驗應給予高度重視。

　　一、培養厭氧菌的基本原則

 

　　厭氧菌培養操作方法並不比需氧菌難，隻要嚴格遵守以下基本原則進行操作，即能成功地進行分離［1］。

 

　　1. 正確地選擇標本：下列細菌學指征有助於選擇標本做厭氧培養：(1) 深部傷口或軟組織膿腫的膿，特別是伴有惡臭或含有硫磺顆粒時。(2) 可疑為氣性壞疽或少見的嚴重產氣或壞死性感染所取得的壞死組織或病灶清除材料。(3) 粘膜部位的感染灶取得的材料。(4) 從腦、肺、肝或其他器官的膿腫或從腹腔內、肛周、隔下或其他部位的膿腫取得的材料。(5) 無菌區感染灶的吸出液，包括血液、腦脊液、腹水、胸水、滑膜液或羊水等。(6) 人或動物咬傷感染灶取得的材料。(7) 變黑的或置於紫外線發紅色熒光的滲出物。(8) 革蘭染色鏡下，觀察到具有厭氧菌獨特形態的材料。(9) 可疑引起肉毒杆菌食物中毒的食物。

 

　　2. 正確地收集標本：厭氧菌是人體許多部位(如皮膚、口咽部、腸道和泌尿生殖道)正常菌群中的一部分，因此下列材料無需做厭氧培養：(1) 咽、鼻、尿道、陰道或直腸拭子。(2) 咳出的痰，通過支氣管鏡取的分泌物，排出或導出的尿、糞便及胃內容物。為排除或盡量減少正常菌群中厭氧菌的汙染，用注射器抽取標本比用拭子更好，特別適用於下列臨床情況：(1) 從未開放的膿腫抽取膿液。(2) 通過胸腔穿刺抽出的胸腔液。(3) 尿(從恥骨聯合上方做膀胱穿刺吸出或從腎造口管收集)。(4) 肺分泌物(氣管切開吸取)。(5) 腹腔液(穿刺抽出)。(6) 通過腰椎穿刺抽出腦脊液。(7) 竇道標本可插入小導管，用注射器吸出。也可自竇道損傷部位取材做活組織檢查。注射器和針頭內的氣體應全部排出，將其內容物直接注入一個已排出氣的無菌試管內。如果必須使用拭子，應盡快接種於適宜培養基中。將取材的拭子、塑料導管內的小量液體、吸入注射器的標本及時裝入厭氧生物袋或管，在運送過程中要保持厭氧狀態。培養基內不應含有肝素，因它會抑製細菌生長。

 

　　3. 正確地運送標本：一旦臨床標本離開人體部位，進入厭氧環境前，必須防止大氣中氧的毒性作用。為此強調使用已排氣的不含氧小管收集標本，可自行製備或使用商品容器。後者是由帶有凹陷的丁基橡皮塞試管和螺旋蓋組成，該管內裝有預還原的無營養成分的含有半胱氨酸和刃天青指示劑的培養基，經過無氧CO2衝洗，高壓滅菌，手套箱內製備的。將抽取標本經橡皮塞注入管內，送實驗室。管內厭氧菌最少存活24～48 h。若不能在2～3 h內接種培養則應保存於15℃。這樣即使是對冷敏感的脆弱類杆菌仍可存活。將注射器內標本裝入無氧塑料袋也可有效地運送。短時間(20 min內)運送，隻用注射器裝袋就可以。組織塊可裝入無氧塑料袋內運送。

 

　　4. 使用新配製的培養基：初代接種厭氧菌最好使用新配製的培養基，它的質量最好。平板培養基無需在厭氧條件下貯存，用前可進行預還原，但厭氧貯存可延長培養基的有效期。如果厭氧貯存時間超過72 h，氣袋內不應含有過高濃度CO2。新製備的培養基可裝入經反向折迭的塑料袋內，放冰箱內可存至兩周。

 

　　5. 提供可靠的厭氧環境：使用厭氧罐法或厭氧箱法。Gaspak厭氧罐［1］適用於100 mm和150 mm的兩種平皿，並有一次性使用的發生氫、CO2試劑袋和一次性使用的厭氧指示劑(美藍或刃天青)，再加催化劑鈀粒使之成為既簡便又實用的厭氧培養裝置。

 

　　在10～15 min內凝結水使罐內或罐的內壁上呈現霧狀，同時催化劑反應室部位透過罐蓋變得溫熱時，即達到了無氧。如果在20～40 min內不出現上述現象，可能是催化劑用量不足，或老化，或未充分活化；或厭氧罐蓋不嚴。過夜孵育後，美藍或刃天青指示劑應出現無色。罐內壓力應稍大於罐外大氣壓，以免氣體反流。

 

　　因為氫是一種易燃易爆氣體，使用時謹防實驗室事故發生。必須熄滅其附近的火焰，厭氧罐不能有裂痕，罐內金屬網罩必須完整無缺。

 

　　厭氧箱法：帶手套的厭氧箱法是用催化劑和無氧氣體保持箱內厭氧環境，並連接交換台，經過此台標本可出入箱體。

 

　　二、 厭氧生長條件的質量控製——化學指示劑和生物指示劑

 

　　在厭氧培養中必須使用氧化還原指示劑一般采用亞甲基美藍或刃天青。每次要新鮮配製，在試管內將亞甲基美藍(0.5%亞甲基美藍3 ml加水至100 ml)、6%葡萄糖和氫氧化鈉(1/10 mol/L NaOH 6 ml加水至100 ml)3種溶液等量混合並煮沸還原至無色，立即將指示劑管放入預先裝好培養物的罐內，然後加蓋密封並按前述方法充氣。如果能在孵育的整個過程中維持厭氧條件，則指示劑溶液將無色，否則指示劑則變色。刃天青有氧為紫紅色，亞甲基美藍有氧為藍色。

 

　　對營養要求高和厭氧條件要求嚴格的厭氧菌，可使用質控菌溶血芽胞梭菌或b型諾維芽胞梭菌陪同生長，陰性質控菌為綠膿假單胞菌。

 

　　三、 培養物的接種

 

　　多種液體和固體培養基，包括各種選擇培養基可用於臨床標本的初代接種。但沒有哪一種培養基最適於所有厭氧菌生長。補加還原劑和經預還原的培養基，培養效果較好。此外，生長還受培養基成分、貯存時間長短和被檢菌特性的影響。由於許多厭氧菌被兼性厭氧特別是奇異變形杆菌過快的蔓延生長所掩蓋，所以混合標本中總有少部分厭氧菌不能從非選擇培養基上分離出來。大多數類杆菌可在卡那黴素-萬古黴素凍溶血瓊脂培養基上分離出。非選擇培養基和卡那黴素-萬古黴素凍溶血瓊脂培養基兩者結合起來可將厭氧菌檢出率提高到94%。孵育的第1天末有19%被檢出，第2天末可檢出70%。其餘的在3～7日間孵育被檢出。Livingston等證明用50%乙醇與標本混合作用1 h是選擇分離芽胞梭菌的有效方法，用此方法分離芽胞梭菌的效果比加熱處理好。標本收集後應盡快接種，操作方法如下。

 

　　1.用拭子(或注射器取材或負壓取材)接種下列新製備的固體培養基：(1) 胰酶大豆血瓊脂平板(BA)。(2) 含維生素K1(10 μg/ml)和氯化血紅素(5 μg/ml) 的布魯血瓊脂平板(BRBA)。(3) 加維生素K和氯化血紅素的卡那黴素-萬古黴素凍溶血瓊脂平板(KVLB)。(4) 類杆菌膽汁七葉苷瓊脂平板(BBE)。(5) 苯乙醇血瓊脂平板(PEA)(供選用)。

 

　　同時做直接塗片革蘭染色檢查。用鉑銥合金環(不用鎳—鉻合金的，因為它可氧化接種物)三區劃線接種平板，以保證長出單個菌落。

 

　　將拭子直接放入一支或兩支強化的硫乙醇酸鹽的培養基(THIO)管內，輕輕旋轉(避免攪動)。也可選用新煮沸並冷卻的皰肉葡萄糖(CMG)培養基。

 

　　2.如果收到的標本是液體的，則用毛細吸管滴加1滴或數滴於各種平板上接種，同時加幾滴於強化的THIO培養基管底部，不要振蕩。

 

　　3.若被檢標本是組織塊，則立即將其移入無菌的組織研磨器內，用硫乙醇酸鹽混合研碎，最好在厭氧箱內或無氧條件下操作。組織勻漿液的接種方法與液體標本相同。

 

　　4.假如可疑含有芽胞梭菌，還要用乙醇或加熱處理標本，然後接種蛋黃瓊脂(EYA)平板。

 

　　四、直接塗片檢查

 

　　原始標本接種培養基後塗片(如果載玻片已火焰滅菌，也可在接種前塗片)並做革蘭染色。通常拭子上的剩餘標本是足夠用來塗片的。當有足夠的標本或收到兩個拭子時，最好在接種培養基前做革蘭染色，這個塗片檢查可提示需要接種哪些常規不使用的選擇性的或其他需補加的培養基。塗片檢查可看出有無細菌，微生物的類型和大概的數量以及芽胞、形狀和位置(芽胞梭菌)、革蘭陽性菌分枝的特征(放線菌)，成對或鏈狀排列的革蘭陽性球菌(葡萄球菌、鏈球菌、厭氧球菌)和圓形或尖形末端的革蘭陰性杆菌(類杆菌和梭杆菌)。同時，還可看到厭氧菌的多形性和著色不勻性。對血性液體或濃稠分泌物用吖啶橙染色比革蘭染色較易觀察。這些初步結果應該及時向主管醫生報告，以幫助他們正確選用抗菌藥物。塗片檢查可核對培養結果，是實驗室質量控製的一個重要指標。

 

　　五、培養物的孵育：所有接種的培養基均按下述方法35℃孵育

 

　　1. 需氧孵育：BA(血瓊脂)平板在燭缸內(約3%CO2)或CO2孵箱需氧培養。接種THIO肉湯、EMB(伊紅美藍)或麥康凱平板需氧培養。過夜孵育後檢查結果，然後，用需氧培養方法進行分純、鑒定，做必要的抗生素敏感性試驗。

 

　　2. 厭氧孵育：可選用KVLB、BRBA、BBE和PEA，必要時加雞蛋酵母平皿(EYA)或含抗血清平板。這些培養物須放在有氫和CO2發生劑及厭氧指示劑的厭氧環境中，平皿下方鋪一張吸水紙巾用以吸收在孵育過程中形成的過多的水份。48小時後檢查THIO管及固體培養基，如與革蘭染色結果一致，則THIO可被棄去，否則THIO需轉種到BRBA(或其他合適的培養基)上再次進行厭氧培養。所有的平板初次厭氧孵育最少需48 h(生長慢的微生物可能需達7 d)，若不足48 h將厭氧罐打開，即便再重新厭氧孵育，那些對氧高度敏感的厭氧菌株也會終止生長。

 

　　六、培養物的檢查

 

　　經適當孵育後，從Gaspak罐裏取出所有平板，1次僅取空1個厭氧罐以蛺減少平皿不必要的暴露，用放大鏡檢查平板上的細菌生長情況。將觀察到的菌落類型描述記錄在一張工作單上，然後按以下步驟處理：

 

　　1. 挑取每種不同類型的菌落分別接種：(1) 純BRBA平板，在厭氧環境；(2) 巧克力瓊脂平板，置CO2條件下；(3) BRBA平板，在需氧條件下；(4) THIO培養管中孵育。

 

　　2. 純血平板上分區劃線接種：第一劃線區放置卡那黴素(1000 μg/片)、多粘菌素E(10 μg/片)和萬古黴素(5 μg/片)。注意：除多粘菌素外，這些紙片含藥量與那些用於藥敏試驗紙片含藥量不同，故其結果不意味著在抗生素治療中細菌對藥物的敏感性。為快速鑒定厭氧消化鏈球菌，可在第二劃線區內放一個聚茴香腦磺酸鈉(SPS)紙片。為了隨後做硝酸鹽還原試驗，在這個劃線區再放一個及一硝酸鹽紙片。總共5個紙片放於接種物量最大的區域內。

 

　　厭氧BRBA平板，CO2平板和THIO管孵育48 h，需氧培養孵育18～24 h。當上述次代培養的操作正在進行時，這些接種好的平板可以放入室溫下有CO2氣流從底部排出的玻璃缸內，一直到將其置於厭氧環境中為止。玻璃缸頂部裝有一個1/2寸厚的有機玻璃蓋，蓋上有一個小孔可排出CO2，使缸底的CO2形成連續的氣泡。

 

　　3. 同時要在紫外線下檢查初代分離的KVLB平板和BRBA平板上是否存在產黑色Porphyromonas及Prevotella的菌落，其特征是發磚紅色熒光。做最後鑒定的生化和其他試驗參見中華醫學檢驗雜誌1999年增刊［2］。

 

　　4. 過夜和48 h孵育後，分別檢查次代培養的需氧平板和CO2平板，如果有菌生長，則很可能不是厭氧菌(少數耐氧厭氧菌可生長)。如果被檢菌未曾做需氧培養，則應繼續按需氧鑒定程序進行鑒定。

 

　　5. 經48 h孵育後，檢查厭氧孵育的次代培養的生長情況及溶血、色素產生、瓊脂凹陷和菌落形態等。如果出現厭氧菌的純培養，則進行革蘭染色鏡檢並記錄結果。革蘭陽性和陰性厭氧菌的快速鑒別方法：(1)稀釋的堿(KOH)破壞革蘭陰性菌的細胞壁；(2) 讀取鑒定用抗菌藥物紙片的結果；使用的3種抗菌藥物紙片，其抑菌環直徑＜10 mm為耐藥；(3) 厭氧消化鏈球菌對SPS紙片可出現直徑12～18 mm抑菌環而絕大多數其他革蘭陽性球菌是耐藥的。其他厭氧菌如放線菌屬和類杆菌屬中某些菌對SPS可能敏感，但也可以耐藥，因此無助於鑒定；(4) 從平板表麵取下硝酸鹽紙片放入一平皿內加常規用的A、B兩試劑各1滴，結果判定同需氧菌。(5) 動力可從THIO內取4～6 h的培養物用載玻片做成密封的懸滴片進行鏡檢。

 

　　6. THIO內的純培養生長物也要做革蘭染色鏡檢，並記錄其結果，要特別注意革蘭染色反應，菌細胞形態及其排列。

 

　　7. 檢查EYA平板上卵磷脂酶和脂酶活性，生長物周圍的培基內形成一個混濁的不透明帶說明存在卵磷脂酶，菌落表麵如有水上浮油般的光澤，則表示有脂酶產生。這個平板還可用來檢查觸酶，方法是置空氣中暴露30 min，然後於菌落上滴加3%過氧化氫觀察有無氣泡產生。

 

　　8.快速靛基質紙片反應：從純血瓊脂平板上取一滿環生長物塗於浸有二甲氨基桂皮醛鹽酸溶液的濾紙片上。產生藍色為陽性反應，無變化或顯黃色表示陰性反應。

 

　　9. 測定膽汁的作用：培養基中加入牛膽汁和去氧膽酸鹽，觀察其抑製還是促進細菌生長。

 

　　10. 耐氧試驗及結果判讀：接種2套培養物，每套含有兩種細菌：1種為被檢厭氧培養生長物，另1種為大腸埃希菌。其中1套置於大氣環境培養，另1套置於厭氧環境培養。如果厭氧培養生長物在厭氧環境和大氣環境中均生長，說明該被檢厭氧培養生長物為兼性厭氧菌；如果被檢厭氧培養生長物在厭氧環境生長，而在大氣環境中未生長，說明該被檢厭氧培養生長物為專性厭氧菌。大腸埃希菌應在兩種環境下均生長。

 

　　七、厭氧菌的快速處理法

 

　　對某些革蘭陰性杆菌和某些芽胞梭菌，可根據革蘭染色具有獨特形態的病原菌做出合理的預測。熒光抗體可用於脆弱類杆菌和產生黑色素Porphyromonas及Prevotella菌的分組。

 

　　當患者病情危重情況下，通常在48 h之前檢查厭氧平板是很重要的，為此可做兩套培養分別置兩個厭氧罐內，以便在24 h檢查其中一套。采用初步分組程序［2］對厭氧菌可作出初步鑒定以指導治療。

 

　　八、生長物的定量

 

　　正規的生長物定量在臨床實驗室內不常做。然而，實驗室至少應該規定出粗略定量方法，可以按+～++++分級方法(如果隻有少數菌落，可簡單表示其數目)分別表示極少量生長、少量生長、中度生長或大量生長。這有助於測知分離物的意義和在混合感染中各種細菌的相對重要性。對燒傷膿毒症和預測其創麵皮膚移植的可接受程度而言，生長物的定量是重要的。有些人認為培養物的定量可預測外科刀口感染，據此決定在早期還是推遲縫合傷口。

 

　　附：厭氧菌分離鑒定程序。

 

 

 

　　九、厭氧菌的耐藥性和藥物敏感試驗

 

　　由於厭氧菌生長緩慢，藥物敏感試驗(藥敏)要經2～4 d才能得到結果，且甲硝基達唑等藥物對大多數厭氧菌有療效，所以過去厭氧菌感染多采用經驗治療，多數情況下效果滿意。但是，近年來，隨著抗菌藥物的廣泛使用，厭氧菌的耐藥性也逐年增高。厭氧菌中最常見的脆弱類杆菌已能產生β-內酰胺酶，破壞青黴素和頭孢菌素。因此，在有條件的實驗室應該開展厭氧菌藥物敏感試驗，特別是嚴重的感染，心內膜炎、腦膿腫和骨髓炎等需長期治療，或經經驗治療而感染仍在繼續或複發，都需進行藥敏測定。厭氧菌藥敏試驗是使用與需氧菌類似的稀釋法。包括全量和微量肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法、濃度梯度等。

 

　　厭氧菌藥敏的質量控製：質量控製的目的是全麵檢查培養基，抗菌藥物濃度和操作技術是否合格。美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)要求每次藥敏試驗至少做2個標準菌株並推薦作為厭氧菌藥敏試驗質量控製的標準菌株和標準菌株對某些抗菌藥物預期的MIC值［3］。

作者：蘇建榮　馬紀平

單位：蘇建榮（100050 首都醫科大學附屬北京友誼醫院檢驗科）；馬紀平（100050 首都醫科大學附屬北京友誼醫院 檢驗科）

 

參考文獻

 

　　1　Baily, William Robert Arthur. Diognostic Microbiology. 9th edition, London: The C.V. Mosby Company, 1994.53-59,85-87,247-276.

　　2　馬紀平，許淑珍.我國厭氧菌檢驗現狀及改進措施.中華醫學檢驗雜誌，1999，22增刊：9-11.

3　National Commitlee for clinical Laboratory Standards. M11-A4. 5th ed. Pennsylvania: NCCLS, 1993.