重組漢坦病毒核殼蛋白抗原診斷腎綜合征出血熱

【摘要】目的　證實重組漢坦病毒核殼蛋白（rNP）對腎綜合征出血熱的診斷價值。方法　用大腸埃希菌表達漢坦病毒76118株S基因獲得rNP，從該病毒感染細胞裂解液獲得天然NP。在相同的捕捉法酶聯免疫吸附測定(ELISA)係統中，比較研究rNP與天然NP的抗原功能。用rNP抗原的捕捉法ELISA檢測臨床血清，與間接免疫熒光（IFA）檢測特異性IgG的結果相比較。結果　用rNP和天然NP平行檢測116份各類血清，兩者符合率達99.21%； 用rNP的捕捉法ELISA檢測610份臨床血清，結果與IFA的符合率為93.61%。結論　rNP抗原的捕捉法ELISA對腎綜合征出血熱具有診斷價值。

 

Recombinant nucleocapsid protein of Hantavirus for detecting hemorrhagic fever with renal syndrome

 

TIAN Junxi, WANG Jingjun, ZHOU Yanping, et al.

　　Shanxi Provincial Station of Sanitation and Anti-epidemic, Xi′an 710054, China

 

　　 【Abstract】Objective　To use recombinant nucleocapsid protein (rNP) of Hantavirus as antigen in IgM-antibody-capture ELISA (MacELISA) to detect the specific IgM in hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS).Methods　rNP was obtained from the small (S) genome segment of Hantavirus strain 76118 in Escherichia coli cells and natural NP from the lysis of cultural cell infected by same virus. The antigen effect of rNP was compared with that of natural NP in a same system of MacELISA. The results of clinical sera detected by MacELISA of rNP antigen was compared to those of specific IgG detected by indirect fluoresecent assay (IFA).Results　116 sera from patients with hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS), rheumatoid, encephalitis B were detected with antigen of rNP and natural NP in MacELISA respectivelyce. Their concidence rate was 99.21%. 610 sera of suspected HFRS were tested by MacELISA of rNP antigen with a coincident rate of 93.61% for IFA. Conclusion　rNP as antigen in MacELISA is valuable for the diagnosis of HRFS.

 

　　 【Key words】Hanta virus; Nucleo proteins;Immunoglobulins; Hemorrhagic fever with renal syndrome

 

　　腎綜合征出血熱(HFRS)是由漢坦病毒引起的急性傳染病，其實驗室診斷方法主要有IgM捕捉法酶聯免疫吸附測定(ELISA)和間接免疫熒光測定(IFA)等技術［1］，所用抗原多來自病毒感染的乳鼠腦懸液或培養細胞裂解液。我們將基因表達的重組該病毒核殼蛋白(rNP)用於捕捉法ELISA，檢測可疑HFRS患者，它有使用安全、抗原穩定、效價高等優點，靈敏性和特異性也較好，現報告如下。

 

　　材料和方法

 

　　一、材料

 

　　1.毒株和基因：漢坦病毒76118株為本站凍存；含該病毒S基因全片段的pGS質粒為Schmaljohn［2］構建。

 

　　2.抗體：抗人μ鏈抗體為Sigma產品。辣根過氧化物酶（HRP）標記抗漢坦病毒核殼蛋白(NP)單克隆抗體由蘭州生物製品研究所和第四軍醫大學提供。

 

　　3.血清：HFRS患者血清49份樣本為我站1993～1999年收集；45份健康人血清來自行業體檢者；10份類風濕因子陽性血清由陝西省人民醫院提供；12份乙腦患者血清為我站收集。

 

　　4.臨床可疑HFRS患者血清，共610份，為省內各醫院送檢的標本。

 

　　二、方法

 

　　1.rNP的製備：用聚合酶鏈反應從pGS中擴增出漢坦病毒S基因全編碼區H1.3S並克隆入pUC18，經鑒定和培養擴大後，亞克隆入pBV220。將該表達質粒轉化大腸埃希菌DH5α，32℃培養至對數晚期，42℃誘生8 h。表達菌液離心收菌體，用50 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(TrisHCl， pH8.0）、100 mmol/L氯化鈉洗滌後重懸，超聲破菌，加0.5%辛基酚聚乙二醇醚(TritonX-100)作用10 min後，離心、沉澱，再離心，沉澱用8 mol/L脲溶解數小時，最後對磷酸鹽緩衝液(PBS)複性。

 

　　2.感染細胞裂解液製備：漢坦病毒76118株感染Vero-E6細胞［1］，IFA檢測病毒強陽性時，將細胞凍融3次，離心收集裂解液。

 

　　3.捕捉法ELISA：抗人μ鏈抗體用1 mg/L包板，加10 mmol/L PBS（pH7.6）稀釋的待檢血清100μl/孔，37℃ 30 min後，用含0.05%吐溫-20的10 mmol/L TrisHCL（ pH7.4）洗板，加100 μl/孔的rNP（10 mg/L，溶於10 mmol/L pH7.6的PBS，含0.02%吐溫-20和5 mg/L的牛血清白蛋白）或感染細胞裂解液（1∶2稀釋），37℃ 60 min，再加HRP-抗漢坦病毒NP單抗100 μl/孔，37℃ 60 min，用四氨基聯苯氨-過氧化氫顯色10 min，2 mol/L硫酸終止反應，在450 nm讀吸光度值(A)。其結果≥2.1×陰性標本平均值，判定為陽性，否則陰性。

 

　　4.IFA檢測：用76118株感染Vero細胞製作抗原片，操作按文獻［1］進行。

 

　　結果

 

　　1.rNP與天然NP的比較試驗：分別用rNP和感染細胞裂解液為抗原，在相同的捕捉法ELISA係統中，平行檢測HFRS患者、健康人和類風濕因子陽性及乙腦患者血清。檢測49份HFRS患者血清的陽性率分別為91.84%和89.80%、符合率為97.96%，健康人及其他患者血清都為陰性，符合率100%。

 

　　2.靈敏性試驗：45份IgM抗體陽性血清，用rNP重組核殼蛋白的捕捉法ELISA測定其最大可稀釋度，結果平均幾何滴度為5 120。

 

　　3.臨床血清檢測：用重組核蛋白(rNP)的捕捉法ELISA檢測610份疑似HFRS患者的血清，與IFA檢測特異性IgG相比較，結果ELISA陽性率60.00%，IFA陽性率61.15%，兩種方法總符合率為93.61%，其中陽性符合率94.10%，陰性符合率92.83%，經配對χ2檢驗分析，兩種方法差異無顯著意義（χ2=0.23 ，P＞0.05）。

 

　　討論

 

　　早期診斷對HFRS的治療和降低病死率極為重要［1］。運用基因工程技術製備活性好、效價高、穩定、安全的抗原，有助於HFRS診斷技術的應用和推廣。NP是漢坦病毒的主要結構蛋白，對病毒的免疫有重要作用，在感染時機體會產生大量的針對性抗體，被公認對病毒感染的診斷有應用價值［2，3］。對編碼NP的S基因片段進行克隆、測序、真核及原核表達的研究，以及證明重組NP與天然NP在抗原性上無明顯的差異，為rNP在診斷中的應用奠定了基礎。國內有將原核表達的rNP用於間接法ELISA，檢測患者特異性IgG［4］和IgM［5］抗體的報道，國外也有相類似的研究［6］。

 

　　我們先用大腸埃希菌表達了漢坦病毒76118株的S基因，將其產物rNP作為抗原用於捕捉法ELISA方法。分別以rNP和感染細胞裂解液（含天然NP）為抗原，在相同的捕捉法ELISA係統中平行檢測了各類血清樣品，結果兩者符合率為99.12%，真陰性率100%，真陽性率分別為91.84%和89.80%，證實rNP與天然NP在捕捉法ELISA中具有相同的功能。再用rNP的捕捉法ELISA檢測610份臨床疑似HFRS血清的特異性IgM，其結果與IFA檢測特異性IgG比較，總符合率是93.61%，其中陽性符合率94.10%，陰性符合率92.83%，經配對χ2檢驗，差異無顯著意義。由於IFA用的是全病毒抗原，所以說明rNP在診斷應用中有與全病毒基本一致的功能，更加證實了該rNP用於捕捉法ELISA對HFRS的診斷價值。

 

　　

作者：田君喜　王敬軍　周燕平

參考文獻

　　1　宋幹，汪誠信，薑克儉，等.流行性出血熱防治手冊.人民衛生出版社，1987.193-208.

　　2　Schmaljohn CS，Jennigs GB, hay J, et al. Coding strategy of the small genome segment of Hantaan virus. Virology, 1986,155:633-643.

　　3　Schmaljohn CS, Sugiyama K, Schmaljohn AL, et al. Baculovirus expression of the small genome segment of hantaan virus and potential use of the expressed nucleocapsid protein as a diagnostic antigen. J Gen Virol, 1988, 69:777-786.

　　4　梁米芳，李德新，杭長壽，等.漢坦病毒S基因在大腸杆菌中的表達和及其初步應用.中華實驗和臨床病毒學雜誌，1993，7：225-229.

　　5　黃長形，李盈盈，楊為鬆，等.腎綜合征出血熱病毒核蛋白在大腸杆菌中表達及產物的初步應用.中華傳染病學雜誌，1996，14：28-31.