三種鑒定葡萄球菌凝固酶方法的評價

［摘  要］ 目的：評價3種鑒定葡萄球菌凝固酶方法的敏感性和特異性。方法：臨床分離的110株葡萄球菌，經革蘭染色、觸酶試驗、ARIS2X鑒定後，用試管法、玻片法、商品乳膠血凝法（slidex staphkit）和凝固酶基因法，鑒定葡萄球菌和評價凝固酶試驗方法。4種方法結果不一致的菌株進行重複試驗。用凝固酶基因法作為“金標準”，比較其他3種凝固酶方法的敏感性、特異性。結果：凝固酶基因法能夠正確判定葡萄球菌凝固酶；試管法有1株菌鑒定假陰性；玻片法有8株菌假定假陽性，2株假陰性；乳膠血凝法有2株假陽性。試管法、玻片法、乳膠血凝法的敏感性分別為98.53％、97.30％和100％；特異性分別為100％、77.78％和94.44％。玻片法鑒定葡萄球菌凝固酶有9.01％的錯誤。結論：乳膠血凝法和試管法敏感性和特異性較高，是鑒定葡萄球菌凝固酶試驗的好方法，玻片法的特異性較差，可能是由於人血漿中產生的葡萄球菌抗體所致。

 

　　［關鍵詞］ 葡萄球菌；鑒定方法；凝固酶；凝集因子

 

　　The Evaluation of 3 Kinds Methods Authenticating Staphylococci Coagulase

 

　　ZHANG Hongsheng

 

　　(The People Hospital of Anyang City, Anyang，He'nan 455000，China).

 

　　Abstract： Objective Evaluates it's sensitivity and particularity 3 kinds of staphylococci coagulas methods .Methods The method is clinical disjunctive 110 stub staphylococcus, after Gram stainhucker modification, Catalase test, ARIS2X authentication ,using the rube method ,the slide agglutination test method ,the sidex staphkit method and coagulase gene method, to authenticate staphylococci and evaluate coagulase test method. The strain will be test again if the result of 4 kind method are inconsistent. As the Coagulasegene method is a "gold standard", evaluate it's sensitivity and particularity lf the 3 kinds of coagulase methods .Results The Coagrlasegene method can authenticate staphylococci coagulase correctly ;There are 1 strain fake negative result by the tube method; 8 strains fake positive result ,2strain fade negative result by agglutination test method;2 strains fake positive result .It's sensitivity is 98.53％、97.30％and 100％,specificity is 100％、77.78％and 94.44％correspond with the tube method ,the slide agglutination test method, the slidex staph kit method and coagulase gene method. There are 9.01％ wrong result by using agglutination test method authenticating staphylococci. Conclusion It's good method to authenticate staphylococci coagulase test by the slidex staphkit method and the tube method with highly sensitivity and specificity .Otherwise ,the specificity of the slide agglutination test method is lower than the others ,perhaps it caused by staphylococci antibody in human plasm.

 

　　Key words：Staphylococcus;Authenticating method ;Coagulase clumping;Factor

 

　　血漿凝固酶試驗是鑒別葡萄球菌的重要試驗之一，凝固酶分為兩種：遊離型凝固酶、結合型凝固酶（凝集因子）。遊離型凝固酶常用試管法鑒定，結合型凝固酶常用玻片法鑒定。近年來許多商家生產了各種鑒定凝集因子的試劑，如乳膠血凝試劑［1，2］。本文采用臨床分離的110株葡萄球菌，以凝固酶基因法為金標準，評價3種葡萄球菌凝固酶的方法。

 

　　1  材料和方法

 

　　1.1  葡萄球菌來源  110株葡萄球菌分離自本院2004年4月至2005年4月臨床患者的血、痰、尿、膿汁等分離、經ARIS2X細菌鑒定儀鑒定。

 

　　1.2  細菌鑒定  所有的菌株均進行革蘭染色、觸酶、凝固酶、ARIS2X細菌鑒定儀鑒定，方法參考［5］。

 

　　1.3  凝固酶試驗  陽性質控菌ATCC 25923，陰性質控菌分離自臨床經係統鑒定的表皮葡萄球菌。以下試驗設有陽性和陰性對照。方法參考［4，5］。

 

　　1.3.1  試管法  兔血漿用生理鹽水稀釋4倍，取0.5 ml加被鑒定葡萄球菌數個菌落，混合後放35 ℃孵箱，3 h～4 h記錄觀察結果；若陰性，然後再放24 h，再觀察記錄結果。大多數金黃色葡萄球菌4 h內均可凝集，極少部分金黃色葡萄球菌須24 h出結果。

 

　　1.3.2  乳膠血凝法凝集試驗  乳膠血凝試劑（slidex staphkit）BioMerieux產品，操作參照說明書。

 

　　1.3.3  玻片法凝集試驗  將生理鹽水1滴放在玻片上，取菌落數個放在其中混合，然後加1滴血漿，混勻後（1 min內）觀察結果。

 

　　1.3.4  凝固酶基因法  采用PCR擴增法，檢測凝固酶基因。引物設計：上遊引物5'GGCGTTAAATAGAAGTGGTTCTGAAGATCCA3'，下遊引物5'CTCTTTTTTCGCTTGTGCTTCACTTTTTCT3'，由上海生物工程公司合成。從過夜純培養物中提取DNA，PCR擴增，94 ℃ 40 s，62 ℃ 40 s，72 ℃40 s共35個循環。然後取擴增產物15 μl加到1.5％瓊脂糖凝膠中，電泳20 min，溴乙錠染色，紫外燈下觀察。在450 bp處出現熒光區帶為陽性結果，以上4種方法結果不一致的菌株，都進行重複試驗。

 

　　2  結果

 

　　2.1  葡萄球菌鑒定結果  經係統生化鑒定和ARIS2X細菌鑒定儀鑒定68株金黃色葡萄球菌，25株表皮葡萄球菌，6株施萊福葡萄球菌，6株孔氏葡萄球菌，3株溶血葡萄球菌，2株華氏葡萄球菌。

 

　　2.2  凝固酶鑒定結果  以凝固酶基因法為“金標準”，比較3種凝固酶試驗的敏感性和特異性，見表1。

 

　　2.3  幾種凝固酶試驗不一致的結果  幾種凝固酶試驗不一致的結果經重複試驗後，最終不一致的結果見表2。

 

　　表1  三種鑒定葡萄球菌凝固酶方法的結果比較（略）

 

　　表2  四種葡萄球菌凝固酶方法不一致的結果（略）

 

　　3  討論

 

　　本研究以凝固酶基因法為檢測遊離和結合凝固酶的“金標準”，評價試管法、玻片法和商品乳膠血凝試驗方法的敏感性和特異性。凝固酶因子試驗和血漿凝固酶試驗是兩個不相關試驗,兩者不能相互替代,也不可相互印證。金黃色葡萄球菌既可產生凝固酶,亦可產生凝集因子。結合型凝固酶又稱凝集因子，主要存在於金黃色葡萄球菌裏昂葡萄球菌和施萊福葡萄球菌中［6，7］。本次調查中臨床分離的施萊福葡萄球菌占葡萄球菌的5.4％，與國內報道近似［3］。檢查凝集因子，傳統的方法采用兔或人血漿與待測葡萄球菌做玻片凝集試驗，該法的缺點是假陽性和假陰性較高，本次調查中有6個表皮葡萄球菌玻片法凝集因子試驗陽性，這可能是由於人血漿中產生的自身抗體或血漿中的抗凝劑所致。乳膠血凝法是用提純IgG的FC段與金黃色葡萄球菌蛋白A（SPA）結合，反應機製是雙鏈式，所以避免了某些金黃色葡萄球菌遊離凝固酶或SPA產生不足所致的假陰性；它用於檢測凝集因子和蛋白質A的乳膠血凝混合試劑，大大提高了檢測凝集因子的特異性。本次試驗它是將純化的纖維蛋白原致敏紅細胞表麵，特異性單克隆抗體（抗A蛋白）包被乳膠，可排除血漿中某些幹擾物質，因而乳膠血凝法準確性佳、操作簡單、敏感性強。遊離型凝固酶主要存在於金黃色葡萄球菌、中間型葡萄球菌和豬葡萄球菌中［6，7］。本次調查中未檢出中間型葡萄球菌，遊離凝固酶陽性的都是金黃色葡萄球菌，因此試管法凝固酶試驗鑒定金黃色葡萄球菌敏感性和特異性都是非常好的。但有1株金黃色葡萄球菌遊離凝固酶試驗陰性，可能是該菌株產生溶纖維蛋白酶，溶解纖維蛋白凝塊，或該菌產生的遊離型凝固酶不足所致。

 

　　參考文獻：

　　［1］  Personne P, Bes M, Lina G, et al. Comparative performances of six agglutination kits assessed by using typical and atypical strains of Staphylococcus aureus［J］. J Clin Microbiol, 1997,35:11381140.

　　［2］  Wllkeraon M,M cAllister S, Miller JM,et al. Comparison of five agglutination tests for identification of Staphylococcus aureus ［J］. Clin Microbiol,1997，35: 148151.

　　［3］  高 霞，李卓成，徐小平.金黃色葡萄球菌凝固酶檢測方法的比較評估［J］. 中國感染控製雜誌，2005，4（3）：257264.

　　［4］  高屹.如何做好葡萄球菌凝集因子試驗［J］.中華醫學檢驗雜誌,1999,22(增刊):43.

　　［5］  葉應嫵，王毓三.全國臨床檢驗操作規程［M］. 江蘇：東南大學出版社，1997：474479.

　　［6］  蔡文城.臨床微生物診斷學［M］. 江蘇：東南大學出版社，1996：287304.

　　［7］  張桌然，倪語星.臨床微生物學和微生物檢驗［M］. 北京：人民衛生出版社，2003：2838.