石韋醇提物抑菌活性的初步研究

【摘要】  目的研究石韋地上部醇提物的石油醚、醋酸乙酯、正丁醇和水4個極性部位對大腸杆菌、普通變形杆菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、藤黃八疊球菌、黃曲黴、青黴、黑曲黴等 8種常見菌的抑製作用。方法采用紙片擴散法進行抑菌試驗，觀察並測量抑菌環的大小。結果石韋醇提物的醋酸乙酯、正丁醇和水相萃取物對供試細菌均有不同程度的抑製作用。其中正丁醇相萃取物和水相萃取物的抑菌效果較好。石油醚相萃取物對這8種供試菌均無明顯抑菌效果，各相萃取物對黃曲黴、青黴和黑曲黴也沒明顯抑菌效果。結論較強極性的提取物對5 種細菌抑菌效果較為突出。

【關鍵詞】  石韋； 極性部位； 抑菌活性

         石韋 Pyrrosia lingua（Thunb.）Farw.又名金茶匙、小葉石韋、象皮草、石茶、牛皮茶等，為水龍骨科多年生常綠附生草本蕨類，作為常用中藥之一，石韋主治腎炎水腫、膀胱炎、泌尿係結石、肺性氣管炎，哮喘、肺膿瘍、咯血、吐血和尿血等［1］。我國石韋資源豐富，在廣西境內分布較廣，武鳴、藤縣、金秀、桂平、梧州、資源和環江均有分布，主要生長在海拔100～1 800 m的石壁或樹幹上。據研究，石韋的主要藥用成分是芒果苷（具抗菌、抗單純皰疹病毒）、異芒果苷（鎮咳祛痰、抗單純皰疹病毒作用）、綠原酸（抗菌、興奮中樞神經等作用）［2～4］，但有關石韋化學成分的抑菌性研究卻很少，藥用狀況複雜，為深入開發這一豐富自然資源，本文對石韋地上部醇提物石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、水不同極性溶劑得到的各部位提取物進行抑菌活性研究，以期探明石韋主要抑菌活性成分的極性部位和適宜的提取溶劑，並為石韋的合理開發提供依據。

　　1  儀器與材料

　　1.1  儀器與材料

　　超淨工作台、手提式滅菌鍋、恒溫控製箱、冰箱、遊標卡尺、鑷子、接種針、三角瓶等；石油醚、醋酸乙酯、乙醇、正丁醇等試劑均為分析純。實驗材料於200711 采自廣西武鳴大明山國家級水源林保護區海拔1 200 m的沿路石壁上或亂石堆環境中，經廣西大學植物分類學黎樺副教授鑒定為石韋P. lingua，將地上部洗淨，自然風幹後磨成粉末，過40目篩備用。

　　1.2  供試菌種

　　供試細菌：大腸杆菌Escherichia coli，普通變形杆菌Proteus vulgaris，金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，藤黃八疊球菌Sarcina lutea。供試真菌：黃曲黴Aspergillus flavas，青黴Penicillium sp.，黑曲黴Aspergillus niger。

   

　　以上菌種均由廣西大學農學院植物保護係微生物學實驗室提供。

　　1.3  培養基細菌用營養瓊脂培養基培養，真菌用馬鈴薯培養基［5］培養。

　　2  方法

　　2.1  菌懸液或孢子懸液製備采用平板菌落計數法［5］。將受試菌在斜麵培養基活化2～3代後，用接種環從斜麵上刮菌苔兩環，分別收集到內盛有100 ml無菌水的250 ml的三角瓶中，將受試菌配成終濃度0.1×107個/ml的菌懸液，備用。

　　2.2  樣液製備石韋地上部醇提取物不同極性部位的製備：稱取粉碎好的石韋樣品4 kg，用體積分數90%乙醇將樣品浸泡3次（料液比 1∶15），每次7 d ，提取液在40°C下減壓蒸餾，回收溶劑，得乙醇浸膏。將乙醇浸膏懸浮於蒸餾水，先後用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇和蒸餾水萃取，分別得石油醚、醋酸乙酯、正丁醇和水4部分萃取物，同前濃縮，即得各極性部位。

　　2.3  石韋抗菌作用的檢測方法采用紙片擴散法進行抑菌試驗［6］。在超淨工作台上將滅菌後的牛肉蛋白腖培養基倒入培養皿中，每皿15 ml，放置冷卻。用無菌移液管取0.1 ml細菌液加於平皿中均勻塗布於平板（內徑 90 mm）表麵後。取經滅菌的標準濾紙（直徑 6 mm），分別蘸取石韋醇提物的不同極性部位並貼於平板表麵，每個培養皿放3片濾紙，以蒸餾水、石油醚為對照液。細菌於37℃培養24 h 、真菌於28℃培養48 h後，檢測抑菌環的有無並測量抑菌環直徑，每種提取液對8種供試菌重複測定3次，結果取平均值。出現抑菌環的菌株才作MIC檢測。

　　2.4  最小抑菌質量濃度的檢測采用紙片擴散法方法同“2.3”，將各溶液稀釋成100，50，25，12.5，6.25，3.125 mg/ml 的質量濃度梯度，以未見抑菌環的最高質量濃度為MIC。

　　3  結果

　　3.1  不同極性部位的抑菌活性的比較對石韋地上部醇提物不同極性部位的抑菌活性進行比較, 這4種溶劑極性大小為：石油醚＜醋酸乙酯＜正丁醇＜水。從表 1可以看出，石韋醇提物的不同極性部位對 5種細菌的影響作用不同，並存在一定的差異，而且同一極性部分對不同種細菌的抑製效果也不同。對 5 種細菌抑菌效果以極性較強的提取物較為突出，正丁醇相和水相對藤黃八疊球菌抑菌較強（見表1），這可能是由於正丁醇相和水相含有活性較高的抑菌成分，化學成分較為多樣且含量高。可見, 石韋地上部醇提物不同極性部位抑菌活性因萃取溶劑不同、菌種不同而有所差異, 這是由於不同極性提取物所含化學成分的類別和含量不同所致。這4部分對金黃色葡萄球菌均無明顯抑菌作用，對大腸杆菌抑製作用較弱，而石油醚相對這5種供試菌均無明顯抑菌作用。醋酸乙酯相對大腸杆菌和金黃色葡萄球菌沒有抑菌作用，正丁醇相對金黃色葡萄球菌也沒明顯抑菌作用。對照實驗均無明顯抑菌環，地上部醇提物不同極性部位對黴菌均無明顯抑菌作用。表1  石韋地上部醇提物不同極性部位對 8種菌的抑製作用（略）

　　3.2  最小抑菌濃度比較由表2可知，石韋醇提取物不同極性部位對受試菌的抑菌效果顯示量效關係。在低濃度時，無抑菌活性，抑製環基本上隨藥液質量濃度的增加而提高，抑菌活性漸顯出來，由此可看出石韋提取物不同極性部位的最小抑菌濃度。隻有正丁醇相對大腸杆菌有抑菌效果，對大腸杆菌的最小抑菌濃度為50 mg/ml。醋酸乙酯相、正丁醇相和蒸餾水相對普通變形杆菌的最小抑菌濃度分別為50，25 mg/ml和12.5 mg/ml，這三相對枯草芽孢杆菌的最小抑菌濃度分別為50，25 mg/ml和12.5 mg/ml，對八疊球菌最小抑菌濃度分別為25，25.00，12.5mg/ ml（見表3），可見，水相的最小抑菌質量濃度最小，其次是正丁醇。石韋地上部醇提物抗菌具有廣譜性，對 5 種細菌均有不同程度的抑殺活性。表2  醋酸乙酯相、正丁醇相、蒸餾水相的抑菌環直徑大小（略）表3  醋酸乙酯相、正丁醇相、蒸餾水相4種細菌的MICmg·ml-1（略）

    本研究結果表明，石韋醇提物4個極性部位的中強極性部位均含有抑菌活性物質，對 5種細菌有一定的抑製作用。由於不同極性部位中化學成分有明顯差異，不同細菌生長所需要的要素和代謝方式不同，所以其活性也有所差異。整體而言，正丁醇相和水相對普通變形杆菌、枯草芽孢杆菌、藤黃八疊球菌的抑製效果較好。這些細菌對人體致病力較強，如普通變形杆菌是泌尿係感染最常見的病原菌之一，這種感染具有持久性和難治性［7］。藥用蕨類植物的主要活性成分包括生物堿、酚類和黃酮類［8］。石韋屬植物含綠原酸、芒果苷、異芒果苷、β-穀甾醇、綿馬三萜、槲皮素、異槲皮苷和三葉豆苷等［9］。從以上分析可知，石韋活性物質主要集中在中強極性部位，主要的抑菌活性成分存在於正丁醇極性部位和水部分，這可能與生物堿及其鹽類、有機酸、萜類、黃酮及其苷類、甾體等抑菌活性物質有關［10］。綠原酸在高濃度時對大腸杆菌有明顯的抑菌效用［11］。腹腔注射芒果苷, 可明顯降低糖尿病大鼠由於氧化性損傷引起的糖基化血紅蛋白和血清肌酸磷酸激酶（CPK）的量［12］。應對抑菌效果好的醋酸乙酯相、正丁醇相和水相進行分離純化，以便得到抑菌活性較高的化學成分，並對其抑菌作用方式、作用機理作進一步研究。石韋醇提物不同極性部位對黃曲黴、黑曲黴、青黴等黴菌無明顯抑殺效應。石油醚相對這幾種菌均沒有明顯抑菌效果，這與莊惠如等［6］研究發現蕨類醇提物的抗真菌活性不如抗細菌，殷帥文等［13］研究幾種蕨類植物石油醚相抑菌效果相一致。各種供試藥液對不同細菌的生長有不同抑製作用，甚至沒有抑製作用，說明石韋植物裏麵存在著不同溶解性的抑菌物質。

   

　　以往多采用單種溶劑提取粗提物進行抑菌實驗［14,15］，這種方法常由於有效成分含量太低或粗提物成分太雜而引起漏篩現象。本研究中，先采用乙醇提取，再濃縮，並用水、石油醚、醋酸乙酯、正丁醇和水依次對提取物進行萃取，不僅使植物有效成分得到充分提取，避免漏篩，同時也為以後的活性成分分離鑒定奠定了基礎。作為藥用資源石韋具有較強的開發價值，但其抑菌活性具體成分尚不明確，因此，其抑菌活性值得研究。本實驗為進一步研究不同溶劑提取物的具體化學成分打下基礎，也為今後抑菌成分的進一步提取分離指明方向。

作者：李雁群  黎樺  陳超君  覃鋒  王愛勤  黃榮韶  林偉國  《時珍國醫國藥》

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