嗜酸乳杆菌推定的β-半乳糖苷酶基因在大腸杆菌中的功能性表達

【摘要】  目的 在大腸杆菌中誘導表達以嗜酸乳杆菌克隆β半乳糖苷酶基因lacZ，為研究其酶學特性做準備。方法 從嗜酸乳杆菌ATCC 4356中克隆lacZ基因，並構建表達載體pET22blacZH、pQE31HlacZ和pQE31lacZ，然後在大腸杆菌中誘導表達，並測定表達產物的β半乳糖苷酶活性。結果 無標簽的重組嗜酸乳杆菌β半乳糖苷酶LacZ獲得了功能性表達，表達量可達2.28 kU/L.而融合HisTag的重組嗜酸乳杆菌LacZ卻失去了β半乳糖苷酶活性，即使複性也不能恢複。結論 克隆表達的成功為該酶的酶學性質研究和可能的應用打下了基礎。

【關鍵詞】  嗜酸乳杆菌； β半乳糖苷酶； 克隆表達； HisTag；複性

    【Abstract】  Objective To clone and express the lacZ gene of L. acidophilus in E. coli for research of the properties of the putative βgalactosidase. Methods  The lacZ gene was cloned from L. acidophilus ATCC 4356 and was inserted into three recombinant vectors: pET22blacZH, pQE31HlacZ and pQE31lacZ. The recombinant proteins were induced and were identified by SDSPAGE and βgalactosidase assay. Results The recombinant lacZ without tag was expressed as functional βgalactosidase, which yield was 2.28 kU/L, but the two recombinant LacZs with Histag were expressed as proteins without activity and its activity could not recovery by renaturation. Conclusion The study make a base for research of enzymatic properties and probable application in the future.

    【Key words】  Lactobacillus acidophilus;  βgalactosidase;  expression;  HisTag;  renaturation

    β-半乳糖苷酶(βgalactosidase，EC 3.2.1.23)因為能水解牛奶中的乳糖而廣泛的應用於乳品工業［1,2］，又因為便利的顯色反應而普遍應用於分子生物學研究［3,4］。尋找新的β半乳糖苷酶可以促進分子生物學研究和乳品工業發展。

    最近嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）NCFM菌株基因組DNA（GenBank accession No. CP000033)已完成測序［5］。該菌基因組攜帶有3個推定的β半乳糖苷酶編碼基因：lacA、lacZ和lacLM。已知lacLM基因編碼的β半乳糖苷酶是該菌降解乳糖的主要酶［6,7］，而lacZ基因卻功能不明。迄今為止，還沒有關於該基因編碼產物的研究報道。嗜酸乳杆菌lacZ基因和著名的大腸杆菌（Escherichia coli）lacZ基因雖然同名，其序列卻沒有相似性。該基因相似於極端環境微生物的屬於糖苷水解酶42家族（glycoside hydrolase family 42，GH42）的β半乳糖苷酶基因。極端環境微生物中的GH42 β半乳糖苷酶因耐熱［8］、耐鹽［9］、耐低溫［10］或有特殊的底物而受到關注。嗜酸乳杆菌β半乳糖苷酶LacZ可能同極端環境微生物的GH42 β半乳糖苷酶一樣，具有某種獨特的性質，從而應用於分子生物學研究或乳品工業。

    本實驗設計了3個克隆表達載體，試圖在大腸杆菌中大量表達嗜酸乳杆菌GH42β半乳糖苷酶LacZ，旨在為後續的酶學性質研究提供依據。

    1  材料與方法

    1.1  菌株和質粒

    嗜酸乳杆菌ATCC 4356購自中科院微生物研究所菌種保藏庫，培養條件為：在37 ℃下，於MRS培養液［6］中靜置培養24～48 h.大腸杆菌JM109和Rosetta菌株是本實驗室保存，培養條件為：在37 ℃下，於LB培養液中搖振培養過夜。選用本實驗室保存的質粒pET22b和pQE31為表達載體。篩選條件為100 μg/ml的氨苄青黴素。

    1.2  嗜酸乳杆菌β半乳糖苷酶基因的PCR擴增

    嗜酸乳杆菌基因組DNA的提取方法參考文獻［11］。用嗜酸乳杆菌ATCC 4356的基因組DNA為模板，加入下列引物擴增嗜酸乳杆菌lacZ基因： P1:5′CAGGATCCGATGACACAATTATCACG

    TTTTC3′；P2:5′GGCTCGAGATTTCTCAATA

    CTTGAACATCC3′；P3:5′GCCTGCAGCTAAT

    TTCTCAATACTTGAACATCC3′；P4:5′CCGA

    ATTCTAGAGGAAATAAAATGACACAATTA

    TCACG3′.P1和P2擴增的是不帶終止密碼子的lacZ基因的編碼序列，擴增片段長2 018 bp；P1和P3擴增的是帶有終止密碼子的lacZ基因編碼序列，擴增片段長2 021 bp；P4和P3擴增的是從lacZ的RBS到終止密碼子之間的序列，擴增片段長2 033 bp.PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；95 ℃變性40 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸130 s，共20個循環；最後72 ℃延伸10 min.凝膠電泳檢測PCR結果，PCR純化試劑盒回收目的條帶。

    1.3  嗜酸乳杆菌β半乳糖苷酶表達載體構建

    分別用對應的內切酶對PCR產物和載體進行雙酶切，膠回收後用T4DNA連接酶連接，再將連接產物電轉化入宿主菌株。共構建3個重組質粒(見圖1)：（a）是pET22blacZH，由P1和P2擴增的片斷和pET22b連接構成，lacZ基因置於T7啟動子控製下，5′端帶有果膠酶信號肽序列，3′端帶有HisTag.轉化Rosetta菌株，以含氨苄青黴素的LB平板篩選。（b）是pQE31HlacZ，由P1和P3引物對擴增的片斷和pQE31連接而成，lacZ基因置於T5啟動子控製下，5′端帶有HisTag.（c）是pQE31lacZ，由P4和P3引物對擴增的片斷和pQE31連接而成，lacZ基因置於T5啟動子控製下，自帶RBS位點，5′端和3′端沒有任何標簽和多餘序列。（b）和（c）轉化JM109菌株，以含氨苄青黴素、XGal和IPTG的LB平板篩選。雙酶切和PCR初步鑒定重組質粒，並送上海生工公司測序鑒定。

    1.4  重組嗜酸乳杆菌β半乳糖苷酶的誘導表達

    誘導方案為：誘導溫度設為37 ℃、30 ℃、25 ℃和20 ℃；誘導劑IPTG濃度設為：0.1、0.2、0.4、0.6和0.8 mmol/L；培養基設為含0.5 %乳糖的LB培養基和普通LB培養基。120 r/min搖床培養重組菌株pET22blacZH/Rosetta、pQE31HlacZ/JM109和pQE31lacZ/JM109各10 ml，培養至OD600≈0.6，加IPTG誘導8 h.取3 ml表達菌液，6 000×g離心2 min收集菌體，再用300 μl ddH2O將菌體混懸均勻，在冰上用超聲波破碎菌體，12 000×g離心30 min，收集上清液測定其β半乳糖苷酶比活力。重懸的超聲沉澱、超聲上清液和重懸的菌體一並做SDSPAGE分析。用Bradford法測定蛋白質濃度。

    1.5  重組β半乳糖苷酶的酶活性測定

    酶活性測定方法根據文獻［12］修改：在200 μl反應液（22 mmol/L ONPG，50 mmol/L Na3PO4，pH 6.6）中加入10 μl適當稀釋的試驗樣品，37 ℃溫育10 min後，加入450 μl濃度為0.4 mol/L的Na2CO3溶液終止反應，於420 nm處測定OD值。設定在該反應條件下，每分鍾釋放1 μmol鄰硝基苯酚為1個酶活單位（U）。

    1.6  包涵體表達的重組β半乳糖苷酶的提取和複性

    根據誘導表達實驗結果，在37 ℃培養構建的3株重組菌株各500 ml，加終濃度為0.4 mmol/L的 IPTG誘導表達8 h，然後離心收集表達菌體，用buffer A（50 mmol/L Tris·Cl， 50 mmol/L NaCl，0.5 mmol/L EDTA，5 %甘油，pH 8.0）洗滌後，在冰浴中超聲破菌。然後按照文獻［13］的描述，用Triton X100提取和洗滌包涵體，再用尿素溶解包涵體。將包涵體溶解液在逐漸降低變性劑濃度的溶液中透析複性：透析液Ⅰ(2 mol/L尿素，20 mmol/L Tris·Cl，0.1 mmol/L GSSG，0.9 mmol/L GSH， pH 8.0)，透析液Ⅱ(0.5 mol/L尿素，20 mmol/L Tris·Cl，0.1 mmol/L GSSG，0.9 mmol/L GSH，pH 8.0)，透析液Ⅲ（50 mmol/L Tris·Cl，50 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，70 μl/L β巰基乙醇，pH 8.0）。SDSPAGE電泳和β半乳糖苷酶活性測定檢測效果。用Bradford法測定蛋白質濃度。

    2.1  嗜酸乳杆菌β半乳糖苷酶基因的表達載體

    以嗜酸乳杆菌基因組DNA為模板的3個PCR均得到了預期條帶。酶切、連接和電轉化後，均篩選到了轉化子。其中pQE31lacZ/JM109的轉化子在篩選平板上呈現為藍色菌落；而pQE31Hlac Z/JM109的轉化子在篩選平板上仍然呈現為白色菌落。這個現象提示pQE31lac Z/JM109菌株表達了有活性的重組β半乳糖苷酶，而pQE31Hlac菌株表達的重組β半乳糖苷酶可能沒有活性。雙酶切、PCR（見圖2）及測序證實3種重組質粒pET22blacZH、pQE31HlacZ和pQE31lacZ均構建成功。測序表明克隆序列和嗜酸乳杆菌NCFM菌株lacZ序列100 %相同。序列提交GenBank，登錄號為：EU590652.

    2.2  重組嗜酸乳杆菌β半乳糖苷酶的表達形式

    經檢測，在各誘導條件下，菌株pET22blacZH/Rosetta的超聲上清液的β半乳糖苷酶比活力和對照菌株（pET22b /Rosetta）超聲上清液的β半乳糖苷酶比活力都沒有顯著區別，表明該重組菌株很可能不表達有活性的重組LacZ.SDSPAGE結果顯示在全菌樣品和超聲沉澱樣品中均存在一個顯著的約70 kDa（接近嗜酸乳杆菌LacZ的理論分子量76 583 Da）的表達條帶，但是在超聲上清液中卻沒有明顯的70 kDa表達條帶（見圖3B）。因此判定C端融合HisTag的重組LacZ的表達形式為包涵體表達。

    pQE31HlacZ/JM109在各誘導條件下的超聲上清液中都測不到β半乳糖苷酶酶活，表明該重組菌株不能表達有活性的重組LacZ.SDSPAGE顯示了和pET22blacZH/Rosetta相似的結果（見圖3A），因此判定N端融合HisTag的重組LacZ的表達形式也為包涵體表達。

    pQE31lacZ/JM109在各誘導條件下均能在超聲上清液中檢測到β半乳糖苷酶酶活性，說明該菌株實現了無標簽重組LacZ的可溶性表達。在誘導條件為25 ℃、0.4 mmol/L IPTG和含0.5 %乳糖的LB培養基時，超聲上清液中β半乳糖苷酶活性最高，比活力達到1.14 U/mg。據此推算，誘導後菌液中的β半乳糖苷酶單位約為2.28 kU/L.SDSPAGE顯示在超聲上清液中有明顯的表達條帶（見圖3D）。不過在37 ℃下卻主要為包涵體表達，超聲上清液中的表達條帶減弱（見圖3C）。相應的，超聲上清液的β半乳糖苷酶比活力也下降到0.18 U/mg.

    2.3  包涵體表達的重組蛋白的複性

    C端標記LacZ經透析複性後，測得複性後的目標蛋白溶液的濃度為0.43 mg/ml.酶活性測定表明複性蛋白沒有β半乳糖苷酶活性。N端標記LacZ經透析複性後，測得複性後的目標蛋白溶液的濃度為0.35 mg/ml.酶活性測定表明複性蛋白也沒有β半乳糖苷酶活性。而無標簽重組LacZ經透析複性後，測得複性後的目標蛋白溶液的濃度為1.16 mg/ml.酶活性測定表明複性蛋白溶液β半乳糖苷酶活性含量為10.1 U/ml，比活力為8.72 U/mg.

    3  討論

    重組菌株pQE31lacZ/JM109在篩選板上長出藍色菌落；誘導後，其超聲上清液具有β半乳糖苷酶活性（1.14 U/mg，25 ℃），SDSPAGE圖上顯示了明顯的重組嗜酸乳杆菌LacZ條帶（70 kDa）；表達為包涵體的重組嗜酸乳杆菌LacZ也複性成功（8.72 U/mg）。這一組實驗結果表明無標簽的重組嗜酸乳杆菌LacZ實現了功能性表達。

    重組菌株pQE31HlacZ/JM109和pET22blacZH/Rosetta雖然都在SDSPAGE圖上顯示了明顯的重組嗜酸乳杆菌LacZ條帶（70 kDa），但是在超聲上清液中卻沒有重組β半乳糖苷酶活性。這說明重組蛋白的表達形式是包涵體。在包涵體複性實驗中，兩種重組β半乳糖苷酶（HLacZ和LacZH）都不能測得酶活性。說明這兩種重組β半乳糖苷酶都沒能重折疊為有活性的構象。比較無標簽重組LacZ的成功複性，作者推論，很可能是融合的HisTag阻礙了重組蛋白的正確折疊。利用NCBI網站的保守結構域檢索工具進行檢索，發現嗜酸乳杆菌LacZ的C端和N端均存在保守結構域，分別稱為GH42 β半乳糖苷酶N端結構域和GH42 β半乳糖苷酶C端結構域。顯然HisTag對這兩個結構域的影響是複性失敗的可能原因。

    重組質粒pQE31lacZ的克隆方式是獨特的。該克隆方式可確保重組蛋白的氨基酸序列不會因克隆帶上附加序列。如果隻利用pQE31質粒多克隆位點(MCS)的酶切位點構建重組質粒，表達的重組蛋白的N端將帶上有利於純化的HisTag.但是HisTag有可能會影響重組蛋白的活性。如果利用pQE31質粒lacO與RBS之間的Eco R I酶切位點和MCS上的任意酶切位點構建重組質粒，就能切掉pQE31質粒的HisTag和RBS位點。在目標片段上帶上RBS，表達的重組蛋白將沒有任何附加的氨基酸殘基，這就確保不會因克隆而導致重組蛋白不同於親本蛋白。若為了研究蛋白的活性而進行的克隆，顯然這個克隆策略最好。

    嗜酸乳杆菌β半乳糖苷酶LacZ和極端環境微生物的GH42 β半乳糖苷酶屬於同一糖苷水解酶家族，很可能該酶像極端環境微生物的GH42 β半乳糖苷酶一樣具有令人感興趣的酶學特性。目前還沒有該酶的克隆表達報道。本文設計了3個表達載體，表達了3種重組LacZ，分別為N端標記HisTag、C端標記HisTag和無標簽的重組LacZ.其中無標簽重組LacZ實現了功能性表達，為該酶的酶學性質研究和可能的應用打下了基礎。

作者：潘渠  胡福泉  陳恬  邱嶽  王廣科  李晉川《成都醫學院學報》

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