芍藥離體組織培養方法

芍藥是我國著名的觀賞、藥用植物，經過幾千年的人工栽培選育，芍藥優良品種的雄蕊、雌蕊大部分瓣化，結實率低，且由於異花授粉，種子也無法保持母本的優良性狀。芍藥繁殖主要以分株為主，繁殖係數低，給芍藥產業化發展帶來困難。芍藥的離體培養研究目前做得較少，現將芍藥離體組織培養方法介紹如下：

 

    供試材料中，種子、胚和上胚軸選自單瓣品種‘罌粟子’當年套袋成熟飽滿的種子，莖尖選自重瓣型品種的休眠芽。

 

    種子采集接種時間分別為8月、10月、1月、3月，培養基選用1／2MS固體培養基，遮光處理。種子胚根長至3厘米以上時置於冰箱中4℃冷藏30天，後轉至白天25℃、夜晚18℃的地方。葉片展開後進行芽增殖培養，光照每天12小時，光強1500至2000勒克斯。

 

    試驗結果顯示，用芍藥種子作為外植體應保留種皮。去除種皮的種子接種2周後極易褐變被汙染而死亡。少數種子的胚根伸長0.5厘米，也出現生長停止、逐漸死亡的現象。去除種皮使種子的胚乳與培養基直接接觸，易導致褐變。未去除種皮的種子在40天左右陸續裂口，長出胚根。

 

    種子在試管中生根後，根生長緩慢，3個月未見上胚軸發芽展葉，且逐漸褐變死亡。而將發根後的試管苗置於冰箱中4℃冷藏，胚根生長加快，35天後上胚軸頂芽露出，轉至組培室中。7天後子葉中間頂芽開始萌動，葉生長，20天後葉柄伸長展開。一般一粒種子僅展開一兩片葉子，少數種子形成兩個胚軸，展開三四片真葉。

 

    試驗結果表明，以8月、10月、1月接種的種子成活率較高，需經過40至60天後才開始生根，經過低溫處理，打破上胚軸休眠後大都能展葉。

 

    芍藥種子萌發的實生無菌苗生長緩慢，與自然界中芍藥實生苗一樣，隻生長一兩個葉片，無法連續生長。在所試的5種培養基上，不同時期的種子無菌苗均不能增殖和生長。切取無菌苗的上胚軸轉接後，也不能分化出叢芽，主要表現為上胚軸對不同濃度的BA（細胞分裂素）、GA（赤黴素）均不敏感，生長處於停滯狀態，部分外植體基部產生褐變，部分芽尖、葉逐漸枯死。

 

    胚與上胚軸的培養，接種至1／2MS＋BA＋0.2NAA（萘乙酸）和1／2MS＋0.5BA等培養基，pH值調至5.8。為防止褐變，每升添加50至100毫克維生素C，0.3％至0.5％活性炭，培養室溫度25℃±1，每天光照10小時，光強2000勒克斯。

 

    去除了胚乳的胚體積很小，僅兩三毫米，接種在培養基上20天後子葉能在試管中展開，胚根稍有伸長，但胚芽始終未見生長，轉接至不同培養基結果相同。原因很可能是種子胚乳中存在一定活性物質或胚中存在一定抑製物質，隻有與胚乳和胚根共同生長，合成的某種促進物質或解除抑製物質可以協調內源激素關係，促進胚芽生長。

 

    低溫打破休眠後將上胚軸接種在培養基上。30天之後，葉柄伸長，葉展開，較小，表麵皺縮，比接種的種子無菌苗小，易發生褐變。培養基添加活性炭後，可明顯減少褐變汙染。幼苗形成後即出現生長停滯狀態，轉接含不同激素的培養基，變化不大。推測上胚軸生長後處於生理休眠期，休眠解除可能需要一個變溫過程。莖尖培養一部分取地栽苗的休眠芽，剪取帶芽鱗的莖尖進行試驗，另一部分於9月下旬掘起植株，置於4℃濕土中，5周後取芽。除去芽鱗，切取莖尖，用0．1％次氯酸鈉溶液消毒15分鍾，無菌水衝洗3至5次，分別接種到以下3種培養基中：

 

    ①1／2MS＋0.5BA＋GA

 

    ②1／2MS＋1.5BA＋0.5KT

 

    ③1／2MS＋1.0BA＋0.5GA

 

    pH值5.6，蔗糖3％，瓊脂0.8％，50毫克／升維生素C，培養室溫度25℃±1，每天光照14小時，光強2000勒克斯。

 

    不同取樣時間對莖尖培養有影響。露地栽培取材時間在10月至11月，或於9月下旬掘起莖芽，置4℃冷藏處理5至6周，成活率和分化率最高。此時接種，休眠芽萌動，生長迅速，分化的試管苗健壯。取材時間在2月，4℃冷藏8至9周的大部分材料芽鱗已經裂開，芽已伸長，消毒困難，汙染率高。其他時間因芽的休眠尚未徹底解除，內部存在抑製物質，生長緩慢，成活率和分化率均較低。因此，莖尖培養的適宜取材時間應為10至11月或4℃冷藏5至6周。

 

    從不同培養基對芽增殖的影響來看，BA和GA組合的培養基芽分化效果優於BA與KT組合。1.5BA＋0.5KT培養基中叢生芽、葉片數量較少，苗生長較高。在添加BA、GA的培養基中，叢生芽、葉片數量較多，苗壯。繼代培養中，切取誘導芽單芽接種，35至40天後基部形成新芽。但隨著代數增加，叢生芽和葉的數量逐漸減少，苗生長變弱，部分芽尖、葉枯死，出現白化苗。到第四代已基本轉為玻璃苗、白化苗，褐變嚴重。芽增殖以1／2MS附加0.5BA和1.0GA為最佳培養基。