沙門菌屬和誌賀菌屬檢驗

　　1．掌握沙門菌屬和誌賀菌屬細菌的形態及染色特性、生化反應、培養方法及鑒定意義。

　　2．掌握沙門菌屬和誌賀菌屬細菌的血清學鑒定方法。

　　3．掌握肥達試驗的原理、操作方法及結果判斷。

 

　　1．菌種 福氏、宋內誌賀菌、傷寒沙門菌、乙型副傷寒沙門菌。

　　2．培養基 SS平板、中國藍、EMB、MAC、KIA、MIU、硝酸鹽培養基。

　　3．試劑 氧化酶試劑或氧化酶紙片、3％過氧化氫溶液、柯氏試劑、甲基紅試劑、400g/L KOH、誌賀菌診斷血清(包括誌賀菌屬四種多價血清及福氏、宋內誌賀菌單價血清)、沙門菌A～F菌體(O)多價和O及H因子血清；傷寒沙門菌O、H診斷菌液、乙型副傷寒沙門菌H診斷菌液、傷寒或副傷寒患者血清或模擬標本，免疫血清。

　　4．其他清潔載玻片、革蘭染色液、生理鹽水等、試管、40孔試管架、lml吸管、5ml吸管、無菌滴管、洗耳球、37℃或45℃水浴箱等。

 

　　1．形態觀察

　　　(1)革蘭染色：沙門菌屬細菌為革蘭陰性細長杆菌。誌賀菌屬細菌為革蘭陰性杆菌，散在分布。

　　　(2)觀察鞭毛染色標本片：鏡下可見沙門菌屬細菌具有周鞭毛。誌賀菌屬細菌無鞭毛。

 

　　2．菌落觀察

　　　(1)沙門菌屬：將本菌接種在SS、MAC平板上經35℃孵育18～24h。由於本菌不分解乳糖並產堿，故在SS和MAC平板上形成無色、半透明、光滑濕潤、凸起的小菌落，產生H2S的菌落可在SS平板上形成中心帶黑褐色的小菌落。

　　　(2)誌賀菌屬：將本菌接種在SS和MAC平板上經35℃孵育18～24h。由於誌賀菌不分解乳糖，宋內誌賀菌某些菌株可遲緩發酵乳糖，故其在SS平板和MAC平板上形成無色透明的、中等大小的菌落。除宋內誌賀菌菌落外均為光滑型菌落。

 

　　3．生化反應

氧化酶試驗：方法同大腸埃希菌。沙門菌屬和誌賀菌屬細菌氧化酶試驗均為陰性。初步試驗鑒定：挑取誌賀菌和沙門菌的單個菌落分別接種在KIA、MIU和硝酸鹽培養基上，經35℃孵育18～24h，同時做觸酶試驗。其結果見表2—4。

表2-4 誌賀菌屬和沙門菌屬的基本生化反應

	KIA				MIU			氧化酶	觸酶	硝酸鹽還原
	斜麵	底層	產氣	H2S	動力	吲哚	脲酶
誌賀菌	K	A	-/+	-	-	+/-	-	-	+	+
傷寒沙門菌	K	A	-	+/-	+	-	-	-	+	+
乙型副傷寒菌	K	A	+	+	+	-	-	-	+	+

 

最終鑒定：須做全麵生化反應和血清學試驗。

 

　　 4．血清學試驗

　　　(1)誌賀菌屬的分型鑒定：凡生化反應符合誌賀菌屬者均需做血清學鑒定。取1環誌賀菌四種多價血清於載玻片一端，再取少許待測菌與之混合，同時在玻片另一端取待測菌與生理鹽水混合對照。結果：對照呈均勻混濁，待檢菌與誌賀菌四種多價血清混合後，數分鍾內出現肉眼可見的顆粒狀凝集物即為陽性。繼之用A、B、C、D群最常見的單價血清凝集定種。

 

　　　結果判斷、解釋和報告：

　　　　①分離培養未見可疑菌落或經鑒定不符合誌賀菌屬鑒定依據者可報告“未分離到誌賀菌屬細菌”。

　　　　②經分離鑒定後符合鑒定依據者，可報告“分離出××誌賀菌”，若進一步做多種生化反應及因子血清分型後，可報告：“分離出××誌賀菌×型”。

 

　　　(2)沙門菌屬的分型鑒定：如果生化反應及形態學檢查疑為沙門菌，可選用沙門菌的多價診斷血清進行玻片凝集。首先選用A～F組多價“O”診斷血清做玻片凝集試驗。在試驗時應以生理鹽水作對照。血清凝集試驗在5～10min內不出現凝集者可確定為陰性。但若生化反應比較典型，應考慮選用Vi凝集試驗。若凝集，則用無菌生理鹽水將菌洗下，製成濃厚的懸液，加熱100℃、30min，再與A～F組多價“O”診斷血清做凝集試驗。若與A～F組多價“O”血清發生凝集，應再與沙門菌單價因子血清分別做玻片凝集試驗，以確定該菌株屬於哪一組。一般先選用本地區檢出率最高菌型的相應血清做玻片凝集反應。

　　　若已確定哪一沙門菌種後，再分別先用H因子血清檢查第I相抗原，然後檢查第Ⅱ相抗原，最後確定該菌種屬於哪一型沙門菌。

 

　　　結果判斷、解釋和報告：

　　　　①分離培養未發現可疑菌落或經鑒定不符合沙門菌屬細菌鑒定依據者，可報告“未分離出沙門菌”。

　　　　②生化反應符合沙門菌、玻片凝集試驗結果陽性，可初步報告為：“分離到××沙門菌”，或“×群沙門菌”。

 

　　5．肥達試驗

　　　(1)原理：用已知的傷寒沙門菌O、H抗原，甲、乙型副傷寒沙門菌的H抗原(PA、PB)與腸熱症患者血清做定量試管凝集試驗，以出現“2+”凝集的最高血清稀釋度為效價，測定相應抗體含量，用以輔助診斷腸熱症。

　　　(2)試驗方法：為單管稀釋法。準備4排小試管，每排7支並標記，另取中號試管1支，加生理鹽水3．8ml及被檢血清O．2ml，混勻，即為1：20稀釋，總量為4ml。然後取出2ml按每管0.5m1分別放人各排小試管中的第1支試管中。再於上述中號試管內加生理鹽水2ml混勻，此種血清即為1：40稀釋，吸取此稀釋度血清2ml，按每管0.5m1分別加到各排小試管中的第2支試管中。以此類推連續稀釋到各排小試管第6支試管為止，第7支小試管隻加入0.5ml生理鹽水做陰性對照。然後按表2-5操作。

表2-5血清學試驗(肥達試驗)方法

	試驗管(每管0.5ml稀釋血清)						對照管
	1：20	1：40	1：80	1：160	1：320	1：640	生理鹽水
O抗原	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
H抗原	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
PA抗原	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
PB抗原	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
血清最終稀釋	1：40	1：80	1：160	1：320	1：640	1：1280	-

　　

　　　振蕩片刻，置於45℃水浴箱中2h或37℃水浴箱4h，取出置室溫或放冰箱中過夜，次日觀察並記錄結果。

 

　　　(3)結果判斷解釋和報告：先觀察對照管，正確結果應無凝集反應，再分別與對照管比較觀察各試管凝集情況。根據液體透明度和凝集塊多少，以4+、3+、2+、+、-符號記錄。

　　　4+：上清液完全澄清，細菌凝集塊全部沉於管底。

　　　3+：上清液澄清度達75％，大部分細菌凝集成塊沉於管底。

　　　2+：上清液澄清度達50％，約50％細菌凝集成塊沉於管底。

　　　+：上清液體混濁，管底僅有少部分細菌凝集成塊，上清液澄清度僅有25 ％。

　　　-：液體均勻}昆濁，無凝集塊。

 

　　　以呈現2+凝集現象的血清最高稀釋倍數作為該血清的凝集效價。一般認為，傷寒沙門菌O抗體凝集價在1：80以上，H抗體在1：160以上，甲、乙、丙型副傷寒沙門菌凝集價在1：80以上才有診斷意義。

 

　　1．加入診斷菌液時，由對照管開始往前，每管各加O．5ml。

　　2. 結果觀察時不要振蕩試管，先觀察，必要時再輕搖試管使凝塊從管底升起，最後按液體的清濁，凝塊的大小進行記錄，對照管(不凝集)與試驗管同時對著光線往暗處看液體透明度和凝集塊。

　　3.“H”凝集呈絮狀，以疏鬆之大團鋪於管底，輕搖試管即能蕩起，而且極易散開。

　　4．“O”凝集呈顆粒狀，以堅實凝片沉於管底，輕搖試管不易蕩起，且不易散開。