小腸結腸炎耶爾森氏菌檢驗(2)

 

結果分析判定及注意事項

 

（一）一般培養性狀

本菌為革蘭氏陰性杆菌或球杆菌，普通堿性染料易於著色，偶而可見兩極濃染，大小為0.8~3.0μm×0.8μm，多為單個散在，有時排列為短鏈狀或成堆，不形成芽胞，無莢膜，有周鞭毛，但不穩定，於26℃培養物中可見周鞭毛，30℃以上易消失，26℃培養有動力，37℃培養無動力，在22~26℃普通培養基上生長的幼齡菌，球形占優勢，37℃培養時或在陳舊培養物中趨向多形性。最適溫度為22~29℃，能在0~4℃生長繁殖，在腸道細菌所用的培養基上都能生長，但生長速度比一般腸道細菌慢，如在SS瓊脂和麥康凱瓊脂培養基上24h培養後菌落極小，48h可生成圓形、光滑、濕潤、扁平、半透明的菌落，初分離的菌落多為光滑型，連續培養或保存不適，可有粗糙型出現。在去氧膽酸鈉瓊脂上，菌體個體差異顯著，主要呈明顯大小不一，球杆、杆狀並存，有時可見有著色不良的個體，在CIN瓊脂上生長良好，菌落較大，直徑可達1.5~3.5mm，菌落中心呈紅色，周圍有明顯透明環的特點，易於觀察區別。不同型的菌株，菌落大小有明顯不同。在肉湯等液體培養基中生長均勻混濁，一般不形成菌膜。

圖7-1　小腸結腸炎耶爾森氏菌檢驗程序

 

（二）樣品采取和處理

采取的樣品以無菌操作放滅菌容器內，應立即送檢，並注意冷藏，根據樣品的種類分別進行處理，固體食品如肉類及其製品等，均需用均質器打碎或用乳缽研磨後再進行增菌培養。

 

（三）增菌培養

為使受損傷的小腸結腸炎耶爾森氏菌得到較好的恢複和繁殖或由汙染少量細菌的樣品中檢出，必須采用增菌的方法，根據該菌能在0~4℃生長的特點，采用4℃冷增菌，有利於耶氏菌存活和緩慢繁殖，而對大多數其他細菌不利或保持不變，特別適用於含菌量少的被檢材料，同時改良磷酸鹽緩衝液對本菌有一定的選擇性，經冷增菌培養後，分別在7d、14d、21d時進行分離，可獲得較好的檢出效果，雖然增菌時間較長，但可提高檢出率。

 

（四）堿處理

小腸結腸炎耶爾森氏菌比其他革蘭氏陰性細菌生長慢，因其他細菌都能在弱選擇性分離瓊脂平板上生長，尤其在22~26℃情況下仍可生長較快，而耶爾森氏菌往往易被掩蓋。為控製其他細菌的過多生長，采用耶爾森氏菌對弱堿性有較高低抗力的特點，將冷增菌後的樣液，經弱堿液迅速處理15s，立即接種選擇性平板進行分離，此方法可殺死大部分不耐堿的其他細菌，可提高小腸結腸炎耶爾森氏菌的檢出率。必須嚴格掌握處理方法，不宜超過時間，以免影響檢出效果。

檢驗乳品時不需要進行堿處理，增菌培養後可直接進行分離，尤其在細菌汙染較少情況下的樣品，經堿處理後有時對該菌的檢出也能受到影響。

 

（五）分離培養

將上述冷增菌液和堿處理後的培養物分別分離CIN-1平板和改良y培養基，經26℃ 48h培養後觀察，挑選可疑菌落，小腸結腸炎耶爾森氏菌在CIN-I平板上生長菌落較大，扁平，有明顯的邊緣，中心為深紅色，周圍有半透明圓環的特征，成牛眼狀菌落，其他腸杆菌在此培養基上與本菌菌落形態不同，易於鑒別。在改良y瓊脂平板上生長為無色透明、光滑、扁平、不粘稠的菌落。經樣品分離效果比較，改良y的分離率高於麥康凱和SS培養基，因此選用了CIN-I和改良y培養基結合使用，可以達到較好的分離選擇效果。

CIN瓊脂（Cefsulondin-Irgasan-Novobiocin　Agar）是一種對耶氏菌選擇性較強的培養基，為Schienann氏於1979年研製成功的，由於配方中Irgasan成分在我國不易購到，無法應用，經試驗後改用二苯醚代替，其選擇培養基的效果反應相同，因此稱為“CIN-I”。

 

（六）改良克氏雙糖試驗

由上述平板上挑選可疑菌落，接種改良克氏雙糖斜麵進行初篩，26℃ 24h後斜麵底層均變黃色（少數因不發酵或遲緩發酵蔗糖者斜麵可仍為紅色），硫化氫陰性和不產生氣體的培養物做進一步生化試驗。

利用改良克氏雙糖瓊脂斜麵對本菌初篩，比三糖鐵瓊脂斜麵更為可靠。因為有些細菌如變形杆菌、檸檬酸杆菌、克雷伯氏菌等，都可能產生類似耶氏菌的底層和斜麵均產酸的反應，在三糖鐵瓊脂上有15％的細菌反應不一致，難以區分，但在改良克氏雙糖上的反應與其他易於混淆的細菌反應不同，絕大部分的耶氏菌在改良克氏雙糖斜麵上反應一致，耶氏菌甘露醇陽性者為100％，蔗糖陽性者為98％，乳糖則為8％-15％，而變形菌對甘露醇，乳糖則為陰性，即可排除部分非耶氏菌的幹擾。

 

（七）尿素酶和動力試驗

在進行進一步篩選試驗中，尿素酶反應是一項非常重要的生化試驗，注意培養基製做時尿素不要高溫加熱，以防水解影響效果，接種細菌時菌量可適當大些，一般在2~4h培養基變紅，為尿素酶陽性。

同時將此菌接種兩管半固體，分別放37℃和26℃，24h後觀察，小腸結腸炎耶爾森氏菌於26℃培養有動力，在37℃培養不產生動力。

 

（八）生化學性狀

小腸結腸炎耶爾森氏菌的生化學特性較為複雜，與腸杆菌科中其他細菌相比，有許多相似之處，但由於耶氏菌的各種生物型別和血清型別的生理學特性不太相同，其某些生化學性狀有時是不定的，特別是各種因素的影響，如培養條件、時間、溫度的不同，能使某些細菌生化性狀改變，有些細菌對醇類的反應迅速，有的遲緩或不發酵。對其地理分布，菌株來源等也有著一定關係，一般生化反應在22~30℃情況下較為穩定。

 

因此，必須掌握好試驗要求，以免影響對結果的判定。

其生化學試驗項目的選定，各個國家很不一致。本方法采用以下幾項主要生化學項目，是由於增菌和初篩試驗中，基本上排除了非耶氏菌屬的可疑細菌，簡化為屬內鑒別的分型表（表7-1）。

表7-1　小腸結腸炎耶爾森氏菌與其他相似菌的生化性狀鑒別

	小腸結腸炎耶爾森氏菌	中間型耶爾森氏菌	弗氏耶爾森氏菌	克氏耶爾森氏菌	假結核耶爾森氏菌	鼠疫耶爾森氏菌
動力(26℃)	＋	＋	＋	＋	＋	－
尿素酶	＋	＋	＋	＋	＋	－
v-p試驗(26℃)	＋	＋	＋	－	－	－
鳥氨酸脫羧酶	＋	＋	＋	＋	－	－
蔗糖	d	＋	＋	－	－	－
棉子糖	－	＋	－	－	－	d
山梨醇	＋	＋	＋	＋	－	－
甘露醇	＋	＋	＋	＋	＋	＋
鼠李糖	－	＋	＋	－	－	＋

 

注：＋陽性；－陰性；d有不同生化型。

 

（九）血清學

小腸結腸炎耶爾森氏菌的抗原結構較為複雜，目前尚未研究清楚，其血清型主要靠菌體抗原即O抗原，至1984年Wauter等增加為57個型，現已知有84個O抗原因子和19個Ｈ抗原因子，在同一血清型的菌株中，可含兩種或更多的O抗原，用病人分離的小腸結腸炎耶爾森氏菌，其血清型大部分為O：3，O：5，O：8和O：9型，某些O抗原同其他細菌有共同性，如O：9與布氏菌有交叉反應，O：12血清與沙門氏菌有交叉反應等，在流行病學調查中，血清學診斷起著較為重要的作用，但在區分致病性與非致病性上價值不大。

 

進行血清學試驗時，可將被檢菌接種於普通斜麵上，於26℃培養48h，取其培養物用分型血清做玻片凝集試驗，注意同時與生理鹽水作對照，在三糖鐵斜麵上於37℃培養的細菌常為粗糙型（R型），容易產生自凝。