副豬嗜血杆菌的分離鑒定與藥敏試驗

豬嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS) 引起豬的多發性漿膜炎和關節炎，該病又稱為豬革拉斯氏病（Glasser’s disease）。近年來，副豬嗜血杆菌引起的疾病已逐漸成為危害世界養豬業的重要疾病^[1]。副豬嗜血杆菌可以影響從2周齡到4月齡的青年豬，主要在斷奶後和保育階段發病，通常見於5-8周齡的豬，發病率一般在10%-15%，嚴重時死亡率可達50%^[2]。隨著我國規模化、集約化豬場的發展，副豬嗜血杆菌已在我國出現流行趨勢，許多地區都有該病發生的報道 ^[3,4]。筆者對濰坊地區1個豬場疑似豬格拉澤氏病的病例進行了病原的分離鑒定和藥敏試驗，現將結果報告如下。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1 病料：在無菌操作條件下取疑似病豬的肺髒、胸膜、胸腹腔積水、心包積液、心血、關節液和腦組織等。

1.1.2 培養基：巧克力瓊脂平板或胰蛋白腖大豆瓊脂（TSA）。

1.1.3 生化試驗試劑：氧化酶、甘露醇、吲哚、葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、核糖、脲酶和伯膠糖等，均購自杭州微生物試劑有限公司。

1.1.4 藥敏試紙：頭孢菌素、丁胺卡那黴素、氟甲碸黴素、磺胺間甲氧嘧啶、頭孢噻肟、紅黴素、克林黴素、慶大黴素、環丙沙星、恩諾沙星、鏈黴素、土黴素, 均購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2　方法

1.2.1 病理變化觀察

剖檢發病仔豬，觀察肺等組織的病理變化。

1.2.2 觸片鏡檢 

肺組織、心血、胸水和腹水觸片，鏡檢。

1.2.3 細菌分離培養

無菌取肺病變組織、心血、腹膜和胸水劃線接種巧克力瓊脂平板和TSA平板。置37℃培養48h。觀察結果。後挑取單個菌落，再進行純培養。

1.2.4 生化試驗

挑取純化菌落接種於氧化酶、甘露醇、吲哚、葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、核糖、脲酶和伯膠糖等生化鑒定管中，同時加入0.01%的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）5μl，置於37℃5%的CO₂ 培養箱培養48h，觀察結果。

1.2.5 藥敏試驗

將TSA純培養物，吸取0.2mL均勻的塗布在TSA平板上，再把藥敏試紙貼在TSA平板上，置37℃5%的CO₂培養箱中培養48h，測量抑菌環直徑並判定結果。

2　結果 

2.1 剖檢變化觀察

剖檢病死豬,發現胸腔內有大量淡紅色液體、纖維性滲出物；肺髒呈纖維素性胸膜肺炎, 肺臌脹, 暗紫紅色,表麵覆有纖維素性滲出物；支氣管內有淡紅色泡沫樣滲出物；心包積液；腹腔內有大量透明黃褐色滲出液, 有的呈膠腖狀凝塊；全身淋巴結腫大,暗紅色。

2.2 觸片鏡檢

取發病豬的肺組織、心血、胸水和腹膜麵塗片，革蘭氏染色，鏡檢可見革蘭氏陰性的細小杆菌，個別兩極球杆狀革蘭氏陰性菌。

2.3細菌的分離培養

無菌取發病豬的肺髒、腹膜、胸水和心血劃線接種TSA平板，置37℃，5%CO₂培養箱培養48h，出現無色、透明、濕潤、光滑、邊緣整齊的針頭大小小菌落，鏡檢可見大小不一、形態有細長、絲狀的革蘭氏陰性杆菌。接種無NAD的TSA不生長。

2.4生化鑒定

挑取細菌分別接種於生化鑒定管中,生化試驗結果如下。

注：“-” 陰性；“+” 陽性 

2.5 藥敏試驗

　將純化培養的細菌接種於鮮血瓊脂平皿, 用紙片法進行藥敏試驗，37℃培養24 h觀察。結果該菌對氟甲碸黴素、頭孢菌素、丁胺卡那黴素、磺胺間甲氧嘧啶、頭孢噻肟高敏，對紅黴素、克林黴素、慶大黴素、環丙沙星、恩諾沙星、鏈黴素、土黴素低敏。

3　討論

3.1 通過對該豬場流行病學調查，臨床上可初步診斷該病由副豬嗜血杆菌引起。為了鑒定該菌，在試驗室進行了分離菌的形態特征觀察、培養特性和生長特性觀察、生化反應等方麵的實驗，進一步確診為副豬嗜血杆菌。通過藥敏試驗也為下一步副豬嗜血杆菌病的治療提供了依據。

3.2 副豬嗜血杆菌在病料中的分離率比較低，一般患病豬死亡12小時後，在病料中幾乎分離不到，因此需在患豬剖殺或死亡12小時內及時進行病原分離。而且副豬嗜血杆菌對營養要求苛刻，其在巧克力培養基上培養48h生長也較差。一般該菌的分離應采用含NAD、酵母浸出液和10%馬血清的TSA培養基。此外，目前各豬場在實際生產中廣泛使用抗生素，也是副豬嗜血杆菌分離率比較低的原因之一。