製劑無菌檢查及微生物限度檢查方法學驗證及驗證結果的技術評價（1）

 2005 年版藥典無菌檢查法和微生物限度檢查法的最重大增訂是要求對檢驗方法進行驗證，及對驗證方法給出了係統的規定。 這是我國藥品微生物學檢查方法與先進國家藥典接軌、符合國際人用藥品注冊技術要求協調會（ICH ）的要求、邁向科學化、合理化的一個重要標誌，也是促進我國藥品微生物學檢查標準化建設的重要途徑。為了確保開展微生物學檢驗方法的驗證，國家局、藥典會、中檢所都先後發布了要求執行驗證的相關法規和文件[1]

一、驗證的必要性和意義（Why）

1 、隨著科學技術的迅速發展，藥品質量標準中的鑒別、有關物質、含量測定等項的檢測方法都不斷地在精密度、準確度上逐步提高。但2005 年版以前的藥典對藥品微生物汙染檢查方法的準確性、可靠性基本無要求，造成長期來在藥品生產工藝、藥品檢驗、藥品技術審評中對與人民用藥安全有效密切相關的微生物汙染監控、監測方法缺乏警惕和衡量的標準，與先進國家的藥典和藥品技術審評要求脫節。

2 、對所用的檢驗方法進行驗證，是分析測量科學的基本要求，是各種法規遵循工作的基礎。藥品微生物學的檢查作為整個藥品質量體係中的一個環節，也應與化學分析的嚴謹要求靠攏，保證檢驗結果的準確可靠。

3 、通過驗證試驗，可對每種藥品的具體檢驗方法的可靠性及結果的準確性予以確認，從而形成標準化的操作。這是促進藥品無菌、微生物限度檢查走向標準化的重要途徑。

4 、通過對同品種但不同批號或不同生產廠家的產品的微生物學驗證試驗比較，可以發現產品所用原料質量或工藝流程中是否存在汙染抑菌物質的問題，具有藥品質量控製的意義。

二、開展驗證的思路和程序

1 首先了解供試品是否有抑菌性、抑什麽菌。

2 考慮和選擇出適當的方法消除或降低供試品的抑菌性。

3 用實驗證明你所用的方法已消除抑菌性——能使人工加入的各種試驗菌生長良好。特別是能滿足對產品最敏感菌的生長。

4 將所作實驗記錄在案—— 即為確認該供試品在該檢驗量，在該檢驗條件下已充分消除抑菌性，能確保實驗結果正確可靠的驗證試驗結果報告。

以上4 點思路和程序也是對驗證報告進行技術評價和審核時必須注意和考察的4 點。

三、驗證的重點是什麽？（what ）

無菌、微生物限度檢查的驗證試驗可概括描述為：在采用的檢驗方法和過程中，通過分別加入規定量的代表性微生物，以試驗供試品是否在規定的檢驗量、在所采用的檢驗條件下1ഊ無抑菌性，或已充分消除了抑菌性（供試品本身的以及操作係統中可能對微生物生長有影響的各種因素），並且所用方法對微生物生長無不良影響，從而確認檢驗方法的有效性，保證檢驗結果的準確可靠。因此，整個實驗過程中的每一個環節均應有合理的證明，保證其對結果判斷沒有影響。按樣品的檢驗流程，驗證的重點環節分布如下：

樣品

需前處理

不需前處理

有抑菌作用

無抑菌作用

去除抑菌作用

①驗證前處理方法對汙染菌生長、檢出的影響。

③驗證抑菌活性去除方法的有效

性及對汙染菌檢出無影響。

②通過驗

證實驗判

檢驗

What1 ：驗證製成適宜供試液的前處理方法，證明方法對微生物生長、檢出無影響。

What2 ：驗證樣品有無抑菌性、抑什麽菌 ？最敏感的菌是那一個？其結果將直接影響

下續檢驗方法的選擇和操作步驟的進行，並是最終所選檢驗方法和操作步驟合理性的證明。

What3 ：驗證消除樣品抑菌活性的方法，證明方法的有效性及方法對汙染菌生長無影響。

如何選擇合理、適宜、簡單有效的消除抑菌活性的方法是當前驗證工作的關鍵。

驗證報告對以上3 個環節的情況是否都有交待；所采用的方法是否科學、合理、有效，並且提供了實驗的證明，也是對驗證報告進行技術評價和審核時必須注意考察的3 點。

四、怎麽驗證？（How ）

按藥典對樣品無菌檢查的規定和要求，或是微生物限度檢查的規定和要求進行，對每一試驗菌應逐一進行驗證試驗。微生物學的驗證試驗一般分 4 個步驟進行：

1 、製備驗證試驗用菌液——How1 ：

按藥典無菌檢查法中培養基靈敏度檢查項中試驗用菌液製備的方法將規定需用的試驗菌分別製成每毫升中含10 ～100 個菌（CFU ）的供試菌液。驗證報告中應給出各種試驗用菌液的製備和菌液含菌量計數的原始記錄。

2 、樣品的前處理方法——How2 ：

為達到製備成均勻的供試液及為後續采取消除抑菌活性的方法作準備，將所采取的前處理方法應用和參加到驗證試驗中，以證明所用處理方法對各試驗菌的生長無影響。

按供試品的性狀選用以下適宜的方法，或幾種方法聯合使用：

溶解：—— 驗證所用溶液、助溶劑和水浴助溶溫度對微生物生長無影響。

乳化：—— 驗證所用乳化劑和水浴助溶溫度的有效性、使用量及對微生物生長無影響。

破乳：—— 驗證所用破乳劑的有效性、使用量及對微生物生長無影響。

萃取：—— 驗證有機相選擇的合理性、有效性及對微生物生長無影響。

2稀釋：—— 驗證降低供試品相對抑菌濃度的有效稀釋倍數。

離心：—— 驗證所用轉速、時間和微生物的分布情況。

驗證報告中應有采取某種前處理方法的原因有說明，並記錄操作步驟以增加重現性。樣品如不需要特別的前處理就能製成均勻的供試液，那麽這一步驟可省掉，直接進入確定樣品有無抑菌性的How3

3 、確定供試品是否有抑菌性、抑什麽菌——How3 ：

可通過查閱臨床藥物實驗手冊、文獻資料（特別是雜誌“Drug”，每一種新藥上市，都有專門的綜述）、申報資料中的藥效學資料，關注其對不同細菌的MIC 情況、參考已經驗證過的品種、抗菌藥物可根據抗菌譜確定其敏感菌、中成藥如果抗菌譜不清楚，至少需選擇一株細菌和一株真菌來試驗等方法。也可直接通過驗證實驗確定之。

用實驗確定是否具有抑菌性的方法：在規定量的供試液中加入實驗用微生物10~100 個，如微生物生長良好，即說明供試品對該種微生物無抑菌活性。如已用藥典規定的各試驗菌試驗，結果均能生長良好，說明供試品無抑菌性，可用常規方法檢驗之。 將這些試驗記錄在案——就是證明該供試品無抑菌性的驗證試驗部分；如加入的微生物不生長或生長緩慢，說明供試品有抑菌性，將這些試驗記錄在案——就是證明該供試品有抑菌性的驗證試驗部分；如加入的微生物中有某一種菌最不能生長或生長最緩慢，這一種菌就是該樣品的敏感菌。

4 、選擇適當的方法消除或有效降低供試品的抑菌活性——How4 ：

根據供試品特性選擇藥典規定的消除供試品抑菌活性的方法（一種或幾種聯合），或利用藥物化學知識，尋找出其他合理、有效的方法，特別是有效的中和劑（這是值得鼓勵的發展方向）。並通過模擬實驗（驗證試驗）對消除或降低抑菌活性的效果加以檢驗。

無菌檢查中可采用：① 薄膜過濾法 ② 中和法（目前藥典僅收載β－內酰胺酶處理法）。

①薄膜過濾法——適用於液體供試品和可溶於水的固體供試品（隻要性狀許可，應首先采用）。驗證和對驗證結果技術評價的重點是：確定濾膜的適用性、確定衝洗的方法和衝洗液的用量。

②中和法——適用於有對應性，能充分被其滅活抑菌活性的樣品（如β－內酰胺酶滅活β－內酰胺類抗生素、對氨基苯甲酸滅活磺胺類）。驗證和對驗證結果技術評價的重點是：

確定中和劑的有效、證明對汙染微生物的生長無毒性、加入的方法和加入量。

在檢驗製劑是否已消除或降低抑菌活性的驗證試驗中，每種試驗菌為一組，每組兩管，其中一管為供試品加試驗菌管，另一管為試驗菌對照管。

驗證試驗和對驗證結果技術評價的判斷為：如平行3 次的試驗中，各管微生物均生長良好，說明供試品已消除了抑菌活性。可以確定按該方法進行該品種的無菌檢查；如有供試品管的微生物生長微弱、緩慢或不生長，說明供試品仍有抑菌活性，應考慮進一步增加衝洗量或中和劑的用量以消除抑菌活性，並重新驗證，直至驗證證明已充分消除或有效降低抑菌活性。

微生物限度檢查中可采用：

① 培養基稀釋法 ② 離心沉澱法 ③ 薄膜過濾法 ④ 中和法。

①培養基稀釋法——取規定量的供試品/供試液加至較大量的培養基中，使單位體積內的供試品濃度降低至不顯抑菌作用。適用於不能用薄膜過濾法而且抑菌活性較弱的樣品。驗證和對驗證結果技術評價的重點是：確定培養基量增加至多少才能使供試品/供試液不顯抑菌活性。

②離心沉澱法——利用沉降係數差異分離去掉藥渣、含抑菌活性的部分，留下含微生物的部3分。適用於不能用薄膜過濾法等方法的樣品。驗證和對驗證結果技術評價的重點是：確定能將藥渣、抑菌成分部位分離掉而留下微生物部位的有效的離心率。

③薄膜過濾法——同上無菌檢查法中所述。並常可與離心沉澱法聯合使用消除抑菌活性。

④中和法——同上無菌檢查法中所述。

實踐證明幾種方法聯合使用效果更好。其中薄膜過濾法和中和法是最有效的消除抑菌性

的方法。驗證報告中應對樣品所采取的某種消除抑菌性的方法的原因有說明，並詳細記錄操作重點和步驟以增加重現性。

由於製劑的微生物限度檢查由菌數計數和控製菌檢查兩部分組成，所以，在檢驗是否已消除或有效降低抑菌活性的試驗中也應分別進行驗證。