製劑無菌檢查及微生物限度檢查方法學驗證及驗證結果的技術評價（2）

微生物限度檢查中的菌數計數屬於定量實驗。驗證試驗是通過對加入的各種規定微生物的回收率試驗來進行的。驗證中可以僅選用在How3 已確定的敏感菌作試驗，這樣可減少工作量，因為能滿足敏感菌生長的條件必然能滿足其他菌的生長。也可以完全按藥典規定，逐一進行每種試驗菌的驗證：對每種試驗菌均應建立 （1）試驗組（供試液加菌液組）——菌數計數測得CFU1 、（2）菌液組 ——菌數計數測得CFU2 、（3）供試液本身對照組 ——菌數計數測得CFU3 、（4）稀釋劑對照組 ——菌數計數測得CFU4 。 驗證試驗和對驗證結果技術評價的判斷為：應符合 CFU4 ÷ CFU2 ≥70 ％（CFU 1 －CFU3 ）÷ CFU2 ≥70 ％

如兩個回收率均≥70 ％，則說明所用方法已消除了供試品的抑菌活性。可以確定按該方法進行該品種的菌數計數檢查；如回收率小於70 ％，則說明仍有抑菌活性，應考慮進一步采取適宜的措施以消除抑菌活性，並重新驗證，直至驗證結果回收率均≥70 ％證明已充分消除或有效降低抑菌活性為止。

微生物限度檢查中的控製菌檢查屬於定性試驗。在驗證試驗中，應同時設置：（1）目標菌陽性對照管、（2）供試品＋目標菌管、（3）陰性對照管、（4）非目標菌對照管。驗證試驗和對驗證結果技術評價的判斷為：

（1）目標菌陽性對照管菌必須生長良好、（2）供試品＋目標菌管生長良好、（3）陰性對照管必須無菌生長、（4）陰性菌對照必須無菌生長” 則說明試驗成立，並且所用方法已消除或充分減低了供試品的抑菌活性。可以確定按該方法進行該品種的控製菌檢查；如出現“（2）供試品＋目標菌管生長緩慢、或不生長”則說明仍有抑菌活性，應考慮進一步采取適宜的措施以消除抑菌活性，並重新驗證，直至驗證結果中（2）供試品＋目標菌管與（1）目標菌陽性對照管相同，證明已充分消除或有效降低抑菌活性為止。

如出現“（3）陰性對照管有菌生長、（4）陰性菌對照管有菌生長”則說明實驗不成立，所用方法不專屬。應尋找原因並重新驗證試驗。

通過以上4 個步驟的驗證試驗實踐，綜合分析實驗中遇到的所有情況和所采取的方法，原始、真實地記錄下來形成一份詳細的、具有可操作性和重現性的驗證報告。並在產品的質量標準中【無菌】或【微生物限度】項下明確經驗證試驗確定的檢驗操作方法：明確樣品前處理方法、步驟，判斷有無抑菌活性的依據，消除抑菌活性采用的具體方法，以及各方法操作的關鍵點等。

四、什麽時候驗證 (when)

（1）當建立藥品的微生物學檢查方法時。——即當申報新藥時必須附有進行微生物學檢查的方法學驗證的資料。並在藥品質量標準的【無菌】或【微生物限度】項下明確經驗證試驗4確定的檢驗操作方法。

（2 ）產品的組分或原檢驗條件發生改變時。——考察這些改變對微生物生長的影響。

（3 ）定期再驗證 ——考察驗證結果的穩定性和及時發現影響微生物生長的因素。

（4 ）可與產品的微生物學檢查同時進行。

五．方法學驗證結果和驗證報告的技術評價

1 、藥檢所審核企業提交的驗證材料時如何審核？——通過所報敏感菌來驗證結果的可靠性。

2 、新藥注冊審評時如何評價驗證材料？

（1）首先按給藥途徑確定被審品種應符合無菌檢驗還是微生限度檢查，確定驗證項目。

（2）如應做微生物限度檢查，確定該品種規定的微生物限度標準，再確定應驗證哪些項目。

（3）根據上述開展驗證的思路和程序進行審核。

（4）一份技術含量高的驗證材料和驗證結果應能很好地回答出上文所指出的4 個W 。特別是其中的what 和how 的內容：

樣品的前處理方法的合理性，及方法不影響微生物生長的證明；

有判斷供試品有抑菌性、抑什麽菌的依據、資料、實驗記錄證明；

如證明有抑菌性，最敏感菌是那個？

審核所選消除抑菌性的方法，及其合理性、有效性的證明。

檢查經驗證所確定的檢驗方法和條件是否能滿足最敏感菌的要求？等方麵。

（5 ）關注中檢所驗證實驗信息交流平台WWW.antibiotic.cn ，了解當前的一些新動向。如：乳膏類製劑的前處理用Bacl2 溶液作破乳劑、用Mnso4 作為喹諾酮類藥品的中和劑、和其他有效中和劑的開發使用信息等新方法的合理性和有效性考察資料。提高對驗證進行技術評價的能力。

3 、一份標準的技術性驗證報告應由以下部分組成：

一、實驗目的

二、樣品信息

三、驗證方案（初步驗證方案、重新驗證方案，糾正原因）和方案的批準。

四、儀器與實驗材料(培養基、菌種、儀器、設備)

五、方法驗證(方法依據、供試菌液製備、菌液計數、敏感菌選擇、所用方法考察、方法驗證步驟、實驗原始記錄)。

六、驗證結論。

七、【檢查】項下【無菌】或【微生物限度】 具體方法確定。

八、實驗員簽名、驗證報告批準人簽名。

4 、用語規範。

注[1 ] 要求執行驗證的相關法規和文件

為了確保開展微生物學檢驗方法的驗證，國食監注〔2005 〕234 號“關於頒布和執行《中國藥典》2005 年版有關事宜的通知” 國藥典發〔2005 〕98 號“關於執行《中國藥典》2005年版微生物限度檢查法和無菌檢查法有關問題的說明”中檢藥〔2006 〕862 號“第七屆全國藥品檢驗所抗生素室主任工作會議暨全國藥品微生物檢驗方法及標準研討會會議紀要”都作了說明和規定。

[作者簡介] 錢維清，女，主任藥師，從事藥品微生物檢驗及質量控製。