【摘要】 近年對結核杆菌耐藥機製的研究表明，rpoB基因是利福平耐藥相關基因，耐藥株通常發生特定位點基因突變，因此可以通過鑒定突變有無而評估其利福平耐藥性，本文對 方麵研究做 簡要綜述
【關鍵詞】 分子生物學；結核杆菌；利福平；耐藥性
結核病至今仍是世界上一 嚴重的公共衛生問題，估計目 全世界每年有800萬新病例發生，290萬人死於結核病，是當今單一致病菌致死的最主要死因。近十幾年來結核病疫情呈現全球性明顯回升趨勢，產生原因之一是耐藥菌株的產生和播散。1990年我國結核病流行調查結果表明，我國臨床分離株耐藥率達39.9％，初始耐藥率31.7％，複治繼發耐藥率47.8％。利福平是一 主要的抗結核藥物，對利福平耐藥常常導致化療失敗，且被認 是 耐藥菌株的標誌之一。因此，早期迅速對結核患者利福平耐藥性進行鑒定十分重要。現將有關研究進展做一簡要綜述。
傳統方法依靠直接或間接含藥培養進行結核分枝杆菌利福平耐藥性鑒定，這是體外結核杆菌耐藥性的直接證據，並且可以了解其對利福平耐藥程度。但各實驗室間所用培養基不同，檢測方法不同，結果判定標準不一，導致結果報告差異，並且由於結核分枝杆菌本身屬於緩慢生長菌，使得耐藥培養耗時長，通常需8～12周，不能滿足現代短程化療需要。
近年發展起來的應用BACTEC460TB係統進行結核杆菌快速培養及藥敏測定可以 大縮短結果回報時間，但此法建立在培養方法基礎上仍需 天出結果，加之儀器試劑昂貴，有放射性汙染等，限製了臨床廣泛應用。
1 利福平耐藥基因的研究
關於結核杆菌利福平耐藥機製一直存在三種假設，膜通透性改變、耐藥質粒介導及染色體組基因突變（耐藥性有關基因），其中已證實耐藥基因突變與利福平耐藥有密切關係。
對於細菌利福平耐藥基因研究首先在大腸杆菌取得重要突破。首先發現利福平耐藥的大腸杆菌其RNA聚合酶有突變並且隻發生在β亞單位上，並推知產生這種β亞單位突變的基因位點相接，進一步對基因研究獲得了大腸杆菌野生株編碼RNA聚合酶β亞單位基因（rpoB）序列，並發現耐利福平的大腸杆菌有rpoB基因突變。由於編碼RNA聚合酶基因在細菌進化中呈高度序列保守性，根據對大腸杆菌利福平耐藥基因的研究資料，Telenti［1］首先對結核分枝杆菌利福平耐藥基因突變進行了全麵研究，發現在與大腸杆菌rpoB基因突變高發區（Ⅰ區）相應位點（511～533aa）的長69bp片段內，64/66耐藥株有突變發生，而未見於56株利福平敏感結核菌株。此後許多研究都證實這一結果，並發現發生於此區城內新的突變位點［2～5］。而Miller［6］做了這樣一項研究，他應用致點突變技術造成編碼rpoB基因531號氨基酸（參考大腸杆菌基因位點）堿基突變並將其導入利福平敏感的恥垢分枝杆菌株LRZZZ中，使之發生了表型改變，即由原來的利福平敏感株轉為利福平耐藥，也證實rpoB基因突變是導致利福平耐藥的唯一原因。Williams［4］對一患者感染的結核杆菌株發生利福平耐藥表型轉換前後做了rpoB基因序列分析研究，證實表型發生改變後其耐藥基因發生了改變。但ropB基因突變致利福平耐藥詳細機製目前還未十分明了。
2 分子生物學檢測方法
上述對結核杆菌利福平耐藥機製研究取得的重要成果為運用分子生物學方法進行耐藥性評估提供了堅實的理論依據，其技術路線基本上是在用PCR方法對rpoB基因突變集中區域擴增基礎上，對擴增產物進行突變鑒定，歸納如下。
2.1 直接順序法 對突變高發區城序列分析是鑒定突變的最直觀可靠的方法，可以準確判定突變的有無及突變性質，也是其他快速間接鑒別方法的金標準。應用放射性同位素或熒光標記測序法，已發現許多突變位點及不同的氨基酸置換。突變在511～533這一區域內發生率達95％以上，其中以531，526，533，516四個位點最為常見［1～5］。Williams研究了流行病學特征和結核杆菌利福平耐藥突變性質之間的內在聯係，認為突變位點及性質與耐藥模式及程度，IS6110圖譜及地位來源等無明顯相關關係。但Taniguechi［5］有不同意見，他研究結果表明513，526，531位點的突變導致對利福平高度耐藥而其他位點則明顯低度耐藥或根本無耐藥性。總之，直接測序可以得到突變詳細資料，還可以對新發現突變進行鑒定，不足之處是儀器試劑昂貴，操作複雜，成本高，有放射性汙染，不適於普遍推廣應用。
2.2 多聚酶鏈式反應-單鏈構象多態性分析法（PCR-SSCP） 其原理為根據在非變性聚丙烯酰胺凝膠中相同長度單鏈DNA片段泳動距離的改變判定單個堿基變異。由於利福平耐藥突變隻在特定區域內發生，而通過PCR方法擴增這段基因，直接電泳判定突變有無，大大簡化了突變分析操作。Telenti［1］最先評估了放射性同位素標記PCR-SSCP方法的結核杆菌rpoB突變中的應用價值。所有利福平耐藥菌株均成功地被檢測出來，證明此方法特異準確。它可以同時進行大量臨床標本篩選，使結果回報時間縮至48～72h。目前國內外本方法的研究較多，並已有成功用於臨床痰標本及腦脊液標本檢測的報道［2,7,8］。SSCP方法為臨床快速簡便鑒定結核杆菌ropB基因突變開辟了新領域，盡管存在一定不足，如每次電泳均需有標準結核杆菌株對照及有時差異不易區分、不能鑒別沉默突變［9］等，但仍不失為一種有廣泛應用前景的方法。
2.3 雙脫氧指紋圖法（dideoxy fingerprinting, ddF） 在對PCR產和的進行ropB基因突變檢測方法的研究中，Felmee應用了ddF法［9］，這種方法結合運用了雙脫氧末端終止法及SSCP法的原理，它將ropB基因片段複製產物做模板直接加入用於產生類似DNA測序產物的有放射性標記的不同長度的雙脫氧末端片段，再行SSCP，經放射自顯影後得出針對不同突變的特異的ddF。這樣，如果有ropB基因突變，在SSCP電泳中不僅可以從因單鏈構象改變產生的泳動距離差異在SSCP中得以鑒別，同時由於其雙脫氧末端終止位點不同於標準株，雙脫氧末段片段數目也不同而得以區分。Felmee檢測出了有不同突變（其中包括了80％已報道的ropB突變）的所有多耐藥菌株，每一突變均有特異的ddF。在與SSCP分析法的對比研究中，認為ddF方法可以克服SSCP結果受電泳條件、電泳時間影響大，受突變性質（位點及突變堿基）影響大及不能區分出，在時間和成本上都有優越性，但未見有進一步臨床應用情況的報道。
2.4 異源雙鏈形成法（heteroduplex formation, HDF） HDF可用於檢測DNA單個堿基突變或缺失，原理為突變基因與無突變基因PCR擴增產物混合，變性後使其溫度緩慢下降，部分可形成分別來源於突變與敏感株基因的異源雙鏈，同時有部分形成同源雙鏈，電泳後可將二者區分開來，並且突變不同（如單堿基突變，插入或缺失），形成的異源雙鏈遷移距離也不同。Williams［4］用HDF法進行了結核杆菌利福平ropB突變檢測的嚐試，110株RFP耐藥株經HDF檢測得到多條帶形，證明有異源雙鏈形成，而敏感株則隻形成一條同源雙鏈，HDF法與DNA測序法符合率達100％。這種方法操作簡便，判定容易，不需放射性標記，適合應用於臨床，但有關報道較少。
2.5 反向係列探針雜交法（Inno line probe assay, LiPA） LiPA方法基於探針雜交原理，先設計合成一係列探針，覆蓋整個ropB突變高發區，其中S係列探針針對野毒株序列，R係列探針含數個有常見突變序列的探針，還可以設計一個有種屬特異性的探針，將這一係列探針順次固定於同一雜交膜上，在嚴格條件下與親和素標記的PCR產物雜交，檢測雜交信號，根據不同雜交帶譜判定出突變有無及大致位置。這種雜交方法可以同時進行種屬鑒定，檢測試劑盒已有廠家生產，結果判定容易，特異性高，易於標準化。如Beenhouwer［10］應用此法對臨床痰標本的檢測中與藥敏結果對照有97％（65/67）的符合率。最近有學者［11］應用此法同時對結核分枝杆菌進行種屬鑒定及PCR敏感性測定，特異性達100％，對107株已知序列的結核杆菌臨床分離株測定中，61株敏感株全部顯示敏感型雜交帶譜，203株耐藥株除4株外均檢測到突變帶譜，誤診率下降到1.97％。不足之處是操作複雜，成本較高。
以上分子生物學方法對結核杆菌RFP耐藥性檢測應用中均有快速、準確，特異等優點，可在72h內報告結果，可以滿足早期臨床診治需要，是結核杆菌RFP耐藥性測定發展必然趨勢。下一步研究重點是提高臨床標本ropB基因擴增特異性（因其單拷貝存在於基因組中），技術條件標準化、規範化，以及將耐藥性診斷及種屬鑒定同時進行的方法，使其能夠成為直接應用於臨床的有效方法。
作者：章偉《中華醫藥雜誌》
【參考文獻】
1 Telenti, Imboden P, Marchesi F, et al. Lancet, 2003，341:647-650.
2 Teleti A, Imboden P, Marchesi F, et al. Antimicro Agents Chemother, 2003，37:2045-2058.
3 Kapur V, Li LL, Iordanescu S, et al. J Clin Microbiol, 2004，32:1095-1098.
4 Williams DL, Waguespack C, Eisenach K, et al， 2004，35:2380-2386.
5 Taniguichi H, Aramaki H, Nikado Y, et al. FEBS-microbiol Lett, 1996，144:103-108.
6 Miller LP, Crawford JJ, Shinnick TM. Antimicro Agents Chemother, 1994，38:805-811.
7 Scarpellini P, Braglia S, Brambilla AM, et al. J Clin Microbiol, 1997，5:2802-2806.
8 程紹基，嚴碧涯，馬嶼，等.中華結核和呼吸雜誌，1996，19：333-337.
9 Felmee TA, Liu Q, Whelen AC, et al. J Clin Microbio, 2005，33:1617-1632.
10 Beenhouwer HD, Lhiang Z. Jannes G, et al. Tuber Lung Dis, 1995，76:425-430.
11 Rossau R, Traore H, Beenhouwer HD, et al. Antimicro Agents Chemother,1997，41:2039-2098.
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