蠟樣芽胞杆菌及其檢驗——2

　　蠟樣芽胞杆菌引起食物中毒是由於該菌產生腸毒素。它產生兩種性質不同的代謝物，引起腹瀉型綜合症的是一種大分子量蛋白；而引起嘔吐型綜合症的被認為是一種小分子量、熱穩定的多肽。

　　致嘔吐型綜合症的腸毒素至今尚未提純，致腹瀉型綜合症的腸毒素已提純，其純化的腸毒素分子量為55-6.0×10³。致腹瀉的腸毒素能使小白鼠致死。

 

表2：蠟樣芽胞杆菌腹瀉和嘔吐毒素的性狀

 

A、樣品製備

　　無菌操作稱取樣品50g放入滅菌攪拌缸內。加Butterfield�s磷酸鹽緩衝稀釋液450mL，以高速（18.000-21.000rpm）均質2min。用上述1:10稀釋液，連續稀釋供蠟樣芽胞杆菌計數。

B、蠟樣芽胞杆菌平板計數

　　移取10mL均質樣液（1:10稀釋）加到90mL空白液中，從10^-2到10^-6製備一係列稀釋液，充分混勻，並繼續稀釋直到10^-6為止。取樣品的各個稀釋液（包括1:10）0.1mL接種2隻MYP（甘露醇一卵黃多粘菌素瓊脂）平板，用滅菌玻璃棒在每隻平板表麵塗布均勻。將平板置30℃培養24小時，並檢查菌落周圍有沉澱圈者，表示產生卵磷脂酶。蠟樣芽胞杆菌菌落通常是粉紅色，隨著培養時間的延長則更明顯。如果上述反應不清晰，應將平板再培養24小時後計數，從MYP平板上挑取典型菌落5個或更多，移種到營養瓊脂斜麵上供蠟樣芽胞杆菌證實試驗用。

C、蠟樣芽胞杆菌的最大近似數

　　MPN技術被推薦用於食品中低於10個/g蠟樣芽胞杆菌的檢驗。某些不適合用平板計數法的脫水澱粉類食品也可用此法檢驗。

　　在胰酪腖大豆多粘菌素肉湯中接種3管MPN係列，10^-1、10^-2、10^-3的稀釋液各接種1mL於3管。將培養管置30℃培養48±2小時，檢查生長密集、典型的蠟樣芽胞杆菌。將陽性管培養物劃線接種於MYP平板，於30℃培養24-48小時。以下步驟同B。

D、蠟樣芽胞杆菌的證實試驗

　　從MYP瓊脂平板上挑取5個或更多的伊紅粉色，卵磷脂酶陽性的菌落，移種到營養瓊脂斜麵上，置30℃培養24小時。取培養物作了革蘭氏染色和顯微鏡觀察。再用3mm直徑的接種環取培養物到裝有0.5mL滅菌磷酸緩衝稀釋液的13×100mm試管中，充分混懸均勻。用於下列試驗。

·酚紅葡萄糖肉湯

·硝酸鹽肉湯

·改良的V-P培養基

·酪氨酸瓊脂

·溶菌酶肉湯

·MYP瓊脂

　　蠟樣芽胞杆菌的分離物應符合下述條件。

1)革蘭氏陽性產芽胞大杆菌，其芽胞不突出體外；

2）在MYP瓊脂上產生卵磷脂酶而不發酵甘露醇；

3）厭氧培養生長，發酵葡萄糖產酸；

4）還原硝酸鹽；

5）VP陽性；

6）分介L-酪氨酸；

7）在含0.001%溶菌酶的培養基中能生長。

E、蠟樣芽胞杆菌群的鑒別試驗

　　從表1可見D部分所述的生化特性為蠟樣芽胞杆菌群所共有。要鑒別典型蠟樣芽胞杆菌和蠟樣芽胞杆菌群的其它種還需進一步進行下述試驗。

·動力試驗

·根狀生長試驗

·溶菌活性試驗

·蛋白質毒素結晶試驗

　　蠟樣芽胞杆菌具有動力、強溶血、不形成根狀菌落，或不產生蛋白質毒素結晶。

蠟樣芽胞杆菌在4℃、pH4.3、鹽濃度18%的條件下仍能存活或生長。

通過高溫殺菌或適當的冷藏可以控製蠟樣芽胞杆菌的增殖。