1 目的
1.1 了解噬菌體效價的含義及其測定原理。
1.2 學會檢查噬菌體的方法。
1.3 掌握用雙層瓊脂平板法測定噬菌體效價的操作技能。
2 原理
噬菌體是一類專性寄生於細菌和放線菌等微生物的病毒，其個體形態極其微小，用常規微生物計數法無法測得其數量。當烈性噬菌體侵染細菌後會迅速引起敏感細菌裂解，釋放出大量子代噬菌體，然後它們再擴散和侵染周圍細胞，最終使含有敏感菌的懸液由混濁逐漸變清，或在含有敏感細菌的平板上出現肉眼可見的空斑──噬菌斑。了解噬菌體的特性，快速檢查、分離，並進行效價測定，對在生產和科研工作中防止噬菌體的汙染具有重要作用。
檢樣可以是發酵液、空氣、汙水、土壤等（至於無法采樣而需檢查的對象，可以用無菌水浸濕的棉花塗拭表麵作為檢查樣品）。為了易於分離可先經增殖培養，使樣品中的噬菌體數量增加。
采用生物測定法進行噬菌體檢查，約需12h左右，因而不能及時判斷是否有噬菌體汙染。通過快速檢查可大致確定是否有噬菌體汙染，以采取必要的防治措施。根據正常發酵（培養）液離心後菌體沉澱，上清液蛋白含量很少，加熱後仍然清亮；而侵染有噬菌體的發酵（培養）液經離心後其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白，加熱後發生蛋白質變性，因而在光線照射下出現丁達爾效應而不清亮。此法簡單、快速，對發酵液汙染噬菌體的判斷亦較準確。但不適於溶源性細菌及溫合噬菌體的診斷，對侵染噬菌體較少的一級種子培養液也往往不適用。
噬菌體的效價即１mL樣品中所含侵染性噬菌體的粒子數。效價的測定一般采用雙層瓊脂平板法。由於在含有特異宿主細菌的瓊脂平板上，一般一個噬菌體產生一個噬菌斑，故可根據一定體積的噬菌體培養液所出現的噬菌斑數，計算出噬菌體的效價。此法所形成的噬菌斑的形態、大小較一致，且清晰度高，故計數比較準確，因而被廣泛應用。
3 材料
3.1菌種
敏感指示菌（大腸杆菌）、大腸杆菌噬菌體(從陰溝或糞池汙水中分離)。
3.2培養基
二倍肉膏蛋白腖培養液，上層肉膏蛋白腖半固體瓊脂培養基（含瓊脂0.7%，試管分裝，每管5mL），下層肉膏蛋白腖固體瓊脂培養基（含瓊脂2%），1%蛋白腖水培養基。
3.3儀器和器具
無菌的試管、培養皿、三角瓶、移液管（1、5mL），恒溫水浴鍋，離心機、721分光光度計等。
4 流程
4.1噬菌體的檢查
4.2噬菌體效價的測定
5 方法
5.1 噬菌體的檢查
5.1.1 樣品采集
將2～3g土樣或5mL水樣（如陰溝汙水）放入滅菌三角瓶中，加入對數生長期的敏感指示菌（大腸杆菌）菌液3～5mL，再加20mL二倍肉湯蛋白腖培養液。
5.1.2 增殖培養
30℃振蕩培養12～18h, 使噬菌體增殖。
5.1.3 離心分離
將上述培養液以3000rpm離心15～20min, 取上清液，用pH7.0，1%蛋白腖水稀釋至10-2～10-3，用於噬菌體檢查及效價測定。
5.1.4 生物測定法
5.1.4.1雙層瓊脂平板法
5.1.4.1.1 倒下層瓊脂
融化下層培養基，倒平板（約10mL/皿）待用。
5.1.4.1.2倒上層瓊脂
融化上層培養基，待融化的上層培養基冷卻至50℃左右時，每管中加入敏感指示菌 (大腸杆菌) 菌液0.2mL，待檢樣品液或上述噬菌體增殖液0.2～0.5mL，混合後立即倒入上層平板鋪平。
5.1.4.1.3恒溫培養
30℃恒溫培養6～12h觀察結果。
5.1.4.1.4 觀察結果
如有噬菌體，則在雙層培養基的上層出現透亮無菌圓形空斑——噬菌斑。
5.1.4.2 單層瓊脂平板法
省略下層培養基，將上層培養基的瓊脂量增加至2%，融化後冷卻至45℃左右，如同上法加入指示菌和檢樣，混合後迅速倒平板。30℃恒溫培養6～16h後觀察結果。
5.1.5 離心分離加熱法（快速檢查）
取大腸杆菌正常培養液和侵染有噬菌體的異常大腸杆菌培養液，4000rpm離心20min，分別取兩組發酵液的上清液(A1)，一部分於721分光光度計上測定OD650光密度值，另外各取5mL上清液於試管中，置水浴中煮沸2min（A2），檢測A2溶液OD650光密度值，記錄結果。
5.2 噬菌體效價的測定
5.2.1 倒平板
將融化後冷卻到45℃左右的下層肉膏蛋白腖固體培養基傾倒於11個無菌培養皿中，每皿約傾注10mL培養基，平放，待冷凝後在培養皿底部注明噬菌體稀釋度。
5.2.2 稀釋噬菌體
按10倍稀釋法，吸取0.5mL大腸杆菌噬菌體，注入一支裝有4.5mL1%蛋白腖水的試管中，即稀釋到10-1，依次稀釋到10-6稀釋度。
5.3 噬菌體與菌液混合
將11支滅菌空試管分別標記10-4、10-5、10-6和對照。分別從10-4、10-5和10-6噬菌體稀釋液中吸取0.1mL於上述編號的無菌試管中，每個稀釋度平行做三個管，在另外兩支對照管中加0.1mL無菌水，並分別於各管中加入0.2mL大腸杆菌菌懸液，振蕩試管使菌液與噬菌體液混合均勻，置37℃水浴中保溫5min，讓噬菌體粒子充分吸附並侵入菌體細胞。
5.4.4 接種上層平板
將11支融化並保溫於45℃的上層肉膏蛋白腖半固體瓊脂培養基5mL分別加入到含有噬菌體和敏感菌液的混合管中，迅速搓勻，立即倒入相應編號的底層培養基平板表麵，邊倒入邊搖動平板使其迅速地鋪展表麵。水平靜置，凝固後置37℃培養。
5.5 觀察並計數
觀察平板中的噬菌斑，並將結果記錄於實驗報告表格內，選取每皿有30～300個噬菌斑的平板計算噬菌體效價。
計算公式： N=Y/V•X
（Ｎ：效價值，Ｙ：平均噬菌斑數／皿，Ｖ：取樣量，Ｘ：稀釋度）
例如：當稀釋度為10-6時，取樣量為0.1 mL/皿，同一稀釋度中3個平板上的噬菌斑的平均值為186個，則該樣品的效價為：Ｎ＝186／0.1×10-6＝1.86×109。
6 結果
6.1 噬菌體檢查
6.1.1離心分離加熱法
處理方法 OD650光密度值
正常發酵液（對照） 異常發酵液（試驗）
離心上清液(A1)
離心上清液加熱煮沸後(A2)
A2/A1
6.1.2 繪出平板上的噬菌斑檢測結果，指出噬菌斑和宿主細菌。
6.2 噬菌體效價測定
6.2.1 平板上噬菌斑數目
噬菌體稀釋度 10-4 10-5 10-6 對照
噬菌斑數（個）/皿
平均每皿噬菌斑數目
6.2.2 計算噬菌體效價(即噬菌斑形成單位pfu, plague-forming unit).
7 思考
1有哪些方法可檢查發酵液中確有噬菌體存在？比較其優缺點。
2測定噬菌體效價的原理是什麽？要提高測定的準確性應注意哪些操作？
8.3噬菌體與菌液混合後保溫時間越長其吸附率越高的說法對嗎？
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