1 目的
1.1 理解Ames法快速檢測誘變劑和致癌劑原理。
1.2 掌握Ames法快速檢測誘變劑和致癌劑方法。
2 原理
食品安全無論如何怎樣強調都不會過分，迅速而準確地檢測致癌物質是食品安全問題的重要方麵。Ames等人發現90％以上的誘變劑是致癌物質，由此，他們創立了一種快速測定法，即利用是否能引起鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型（hisˉ）菌株的回複突變來判斷化學物質是否誘變劑和致癌劑，並能區別突變的類型（置換或移碼突變）。
這組檢測菌株含有下列突變：① 組氨酸基因突變（hisˉ），根據選擇性培養基上出現his＋的回複突變率可測出誘變劑或致癌物的誘變效率。②脂多糖屏障丟失（rfa），該菌株的細胞壁基因有缺陷，使待測物容易進入細胞內。③紫外線切除修複係統缺失（△uvrB）,同時其附近的硝基還原酶和生物素基因缺失（bioˉ），使致癌物引起的遺傳損傷的修複降低到最小的程度。④抗藥性標記R，表示某些菌株具有抗氨苄青黴素（ampicillin）的質粒，從而提高了檢出的靈敏性。
常用的幾株鼠傷寒沙門氏茵命名為：TAl535、TAl537、TAl538、TA 98、TAl 00、TA 97及TAl02等。這是一係列特異的營養缺陷型沙門氏菌株。檢測菌株TA1535含有一個堿基置換突變，能檢測引起置換突變的誘變劑。TA1537在重複的G-C堿基對序列中有一個移碼突變，能檢測引起移碼的誘變劑。TA100和TA98就是上述菌株分別加上一個抗藥性轉移因子pKM101質粒後的菌株（質粒易丟失，故應盡可能減少傳代）。
有的致癌物的誘變性是被哺乳動物肝細胞中的羥化酶係統活化的，而細菌卻沒有這種酶係統，故加入鼠肝勻漿的酶係統能增加檢測的靈敏度。
鼠傷寒沙門氏菌，對化學致癌物來說，不是決定性的試驗。但是，目前各地資料表明，Ames試驗陽性和致癌之間有十分明顯的相關性。根據Ames本人對300餘種化學品進行的微生物誘變試驗及動物誘癌實驗對比，發現二者之間存在著非常明顯的一致性。
Ames試驗的優點是，方法靈敏，檢出率高，經試驗有90％的化學致癌物經都可獲得陽性結果；加之方法比較簡便、易行，不需特殊器材，容易推廣。缺點是，微生物的DNA修複係統比哺乳動物簡單，基因不如哺乳動物多，不能完全代表哺乳動物的實際情況。盡管如此，由於存在著上述的優勢，故目前在致突變試驗中占重要位置，為首選的試驗方法。
3 材料
3.1 菌種
鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）的幾個測試菌株，其突變標記如下表（略）：
3.2 培養基
3.2.1 底層培養基
葡萄糖20g 檸檬酸2g K2HPO4-3H2O 3.5g MgSO4•7H2O 0.2g 瓊脂（優質）12g 蒸餾水 1000ml pH7.0 8磅滅菌15分鍾 用量1000ml。
3.2.2 組氨酸-生物素混合液
稱31mg L-鹽酸組氨酸和49mg生物素溶於40ml蒸餾水中，備用。
3.2.3 上層培養基
0.5g氯化鈉，0.6g優質瓊脂，加90ml蒸餾水，加熱熔化後定容，然後加入10ml組氨酸-生物素混合液，搖勻後分裝小試管80支，每支3ml，8磅滅菌15分鍾。用量250ml。
3.2.4 “素瓊脂”
0.5g氯化鈉，0.6g優質瓊脂，加90ml蒸餾水，加熱熔化後定容。分裝小試管25支，每支3ml，8磅滅菌15分鍾。用量100ml。
3.2.5 肉湯培養基
牛肉膏3g，蛋白腖10g，氯化鈉5g，瓊脂20g，自來水1000ml。調節pH至7.2～7.4，121℃滅菌20分鍾。用量500ml。
3.2.6 肉湯培養液
在肉湯培養基未加瓊脂前，分裝10支試管，每支5ml。
3.3 肝勻漿S-9
選成年雄性大白鼠3隻（每隻體重在300g左右），稱重，按每公斤體重腹腔注射誘導物五氯聯苯油溶液2.5ml（五氯聯苯用玉米油配製，濃度為200mg/ml）提高酶活力。注射後第5天殺鼠，殺前大鼠禁食24h，取3隻大白鼠的肝髒合並後稱重，用0.15M KCl溶液洗滌3次，剪碎，每克肝髒（濕重）加3ml 0.15M KCl溶液，製成勻漿，離心（9000轉/分 10分鍾），取上清液（即S-9）分裝小試管，每管1～2ml，液氮速凍，-20℃冷藏備用。所用器皿、刀剪、溶液都需保持無菌，並在0～4℃下（也可在冰浴中）操作。
3.4 大鼠肝勻漿混合液
製備方法如下：
3.4.1 0.2M pH7.4磷酸緩衝液
Na2HPO4•12H2O 7.16g， KH2PO4 2.72g，加水至100ml，滅菌後備用。
3.4.2 鹽溶液
MgCl2 8.1g，KCl 12.3g，加水至100ml，滅菌後備用。
3.4.3 NADP（輔酶Ⅱ）和G-6-P（葡萄糖-6-磷酸）使用液
每100ml使用液含NADP 297mg，G-6-P 152mg，0.2 M pH 7.4的磷酸緩衝液50ml，鹽溶液2ml，加水至100ml。細菌過濾器過濾除菌，經無菌試驗後分裝成每瓶10ml的小瓶，-20℃貯存備用。
3.4.4 S-9混合液
取2 ml S-9加入10ml NADP和G-6-P 使用液（將低溫貯存S-9 和使用液室溫下融化後現配現用），混合液置冰浴中，用後多餘部分棄去。
3.5 試劑
3.5.1 亞硝基胍（50μg/ml，250μg/ml，500μg/ml，用甲酰胺0.05ml助溶後用pH 6 的0.1 M 磷酸緩衝液配製）；氨苄青黴素（8mg/ml，用0.02 N的NaOH 配製）；黃曲黴毒素B1（50μg/ml，5μg/ml）；結晶紫（1mg/ml）；生理鹽水，氯化鉀（15M）。
3.6 器皿
3.6.1 常用器皿
培養皿；移液管；試管；15w紫外燈；水浴鍋；圓濾紙片（直徑10mm的厚濾紙）若幹；鑷子；黑紙。
3.6.2 製備肝勻漿的器皿
注射器5m；台秤；剪刀）；燒杯；勻漿管；高速離心機；血清瓶。
４流程
4.1 測試菌株的鑒定
4.2 NTG和黃曲黴毒素B誘變作用的檢測
細菌培養→紙片點樣檢測→培養皿摻人檢測→加S9檢測法→陽性對照和S9活性鑒定
→誘變性的定性鑒定→誘變性的定量鑒定→數據記錄和分析
５步驟
５.1 測試菌株的鑒定
5.1.1 組氨酸和生物素標記的鑒定
將測試菌株TA1535、TA1537、TA100、TA98、S-CK 等於實驗前一天分別挑取一環到5ml肉湯液中，37℃培養過夜，離心洗滌4次。將底層培養基熔化後倒10皿。取10支“素瓊脂”熔化後在48℃水浴中保溫。分別吸取各試驗菌液0.1ml到各試管中，搓勻後立即傾注到底層平板上，每個菌株2皿。用蠟筆劃好3個區，在A點上加微量組氨酸固體（加量約芝麻粒的1/2），B點上加微量組氨酸和生物素，C點作空白對照（圖7-1），37℃培養2天觀察結果。證明除了對照菌株外，其它都是組氨酸和生物素缺陷型。
5.1.2 脂多糖屏障丟失（rfa）的鑒定
倒好肉湯培養基平板10皿，取10支“素瓊脂”試管按5.1.1的方法傾注帶菌的平板，各菌株2皿，在皿中心放一直徑為O．6cm的圓形濾紙，滴上10μl結晶紫溶液(1mg／ml)，37℃培養過夜後觀察結果，測量抑製圈直徑（圖7-1）。
5.1.3 抗藥性鑒定
倒好肉湯培養基平板4皿，在平板中心加0.01ml氨苄青黴素，用接種環輕輕塗成一條帶，置37℃待幹。用蠟筆劃好記號，分別挑取一環試驗菌株，按與氨苄青黴素帶垂直的方向劃線，每皿間隔劃三個菌株，每個菌株劃兩皿，37℃培養過夜，觀察結果（圖7-1）。
5.1.4 紫外線切除修複缺失（△uvrB）的鑒定
倒好肉湯培養基平板4皿，每皿劃三條不同試驗菌的菌帶，每個菌株劃兩皿（圖7-1）。用滅菌的黑紙遮蓋培養皿的1/2，置15瓦紫外燈下（距離30cm），照射8秒鍾，在暗室內紅燈下操作，照好後用黑紙包好，37℃培養過夜，觀察結果。
5.2 NTG的誘變作用 黃曲黴毒素B1的誘變作用
5.2.1 誘變作用的初檢（點滴法）
5.2.1.1 NTG的誘變作用
倒好底層培養基平板18皿。融化上層培養基18支放入48℃水浴中保溫。將在37℃培養約17h的TA1535，TA100，TA98三個菌株的菌液稀釋20倍後，各吸0.2ml菌液入上層培養基試管，搓勻後迅速傾入底層平板上，每個菌株6皿。待凝固後於皿中心放入厚的圓濾紙片，分別加50μg/ml，250μg/ml，500μg/ml的NTG各0.02ml到濾紙片上，即每皿分別是1μg、5μg和10μg，37℃培養兩天後觀察結果。
5.2.1.2 黃曲黴毒素B1的誘變作用
有些誘變劑和致癌劑要經肝勻漿酶係統活化後才能被測出，黃曲黴毒素就是這類物質之一。在測試的前一周事先製備好肝勻漿S-9和含有6-P-G與NADP的pH 7.4 的鹽溶液，分別低溫保存，實驗前將這兩部分化凍後按所需量混合製成S-9混合液，本實驗取2ml S-9 加入10ml pH 7.4的鹽溶液，置冰浴中備用備。
倒好底層培養基平板24皿，熔化上層培養基24支，放入48℃水浴中保溫。將在37℃培養約17小時的TA1535，TA100，TA98三個菌株的菌液稀釋20倍後，各吸0.2ml菌液入上層培養基試管，每個菌株8支，其中4株加S-9混合液各0.2ml，另4株不加，搓勻後迅速傾入底層平皿（S-9混合液加入後要立即傾入平皿，以免酶在48℃中失活）。待凝固後在皿中心放一厚的圓濾紙片，取2皿已加S-9混合液和2皿不加者分別加0.02ml的黃曲黴毒素B1（每ml含有50μg黃曲黴毒素B1）。37℃培養兩天後觀察結果。
5.2.2 突變頻率的測定
點試法簡便，但僅能作為初步的定性測定，隻有嚴格地測定了誘發回複突變頻率後才能得到陽性或陰性的肯定結論。
5.2.2.1 NTG誘發回複突變的頻率
倒好底層培養基平板12皿，熔化上層培養基12支，48℃水浴保溫。分別吸取稀釋20倍的菌液各0.2ml和NTG（50μg/ml）0.1ml，放入上層試管中，搓勻後立即傾注到底層平板上，每個菌株2皿，每皿含NTG 5μg。另外分別吸取0.2ml菌液入上層試管中，搓勻後立即傾注到底層平板上作對照，每個菌株2皿，37℃培養兩天後觀察結果，計算自發回複突變率和誘發回複突變率。凡誘發回複率超過自發回複突變率2倍以上者屬於陽性，低於2倍者屬於陰性。
為了計算突變頻率，必須同時測定各菌液的活菌數目。為此需將上述三菌株的20倍稀釋液再稀釋至10-5、10-6後各取0.1ml；與肉湯培養基混皿，各菌株4皿，37℃培養兩天後計數。
5.2.2.2黃曲黴毒素B1誘發回複突變的頻率
倒好底層培養基平板24皿，熔化上層培養基24支， 48℃水浴保溫。分別吸取稀釋20倍的菌液各0.2ml到上層培養基試管，每個菌株8支，其中4株加S-9混合液各0.2ml，另4株不加。分別取2支加S-9混合液和2支不加者到含有5μg/ml的黃曲黴毒素B1各0.2ml（即每皿含有1μg B1），搓勻後立即傾入底層平板上。其餘4支不加B1者也搓勻傾入底層平板上。待凝固後置37℃培養兩天後計數。
活菌計數與4.2.2.1相同。
6 結果
6.1 記下測試菌株的鑒定結果
6.1.1 組氨酸和生物素標記的鑒定。
6.1.2 脂多糖屏障丟失的鑒定。
6.1.3 抗藥性的鑒定。
6.1.4 紫外線切除修複缺失的鑒定。
6.2 把NTG和黃曲黴毒素B1誘變作用的初檢（點滴法）結果記在下表中
表7-2 NTG誘發回複突變的初檢結果
表7-3 黃曲黴毒素B1誘發回複突變的初測結果
6.3 誘發回複突變頻率的測定結果
表7-4 NTG誘發回複突變頻率（％）
表7-5 黃曲黴毒素B1誘發回複突變頻率（％）
菌株 誘發回複突變（加黃曲黴毒素B1） （自發回複突變（不加B1）
7 思考
7.1 為什麽可以用細菌檢測致癌物質？
7.2 對致癌物質檢測為什麽選用回複突變基因作標記？
8 注意事項
8.1 鼠傷寒沙門氏菌是條件致病菌，所以用過的器皿應放入石碳酸中或進行煮沸滅菌，培養基也應經煮沸後倒棄。
8.2 肝勻漿的提取應重視無菌操作，並應做無菌測定，入無低溫條件時，提取過程盡可能用冰浴保持低溫。S-9混合液要在使用時隨時配製。
8.3 倒底層培養基時，待融化好的培養基冷卻到45～50℃時倒皿，盡可能減少平板表麵的水膜，防止上層“滑坡”，能預先在37℃過夜則更好。
8.4 NTG和黃曲黴毒素都是強烈致癌物，操作時要膽大心細，切勿用嘴吸取，用過的器皿要用水大量衝洗或放入0.5M硫代硫酸鈉中解毒後方可清洗。
6 結果
霍德華黴菌計測數值，又稱黴菌數，用百分比表示。其含義如下：
將0.15mm3標準樣液，均勻地攤布成厚0.1mm，直徑為1.382mm，其麵積為1.5mm2的標準視野，在顯微鏡下檢查。按100個視野數計算，其中發現有黴菌菌絲存在的視野數（即陽性視野數）。
根據黴菌數含義，其計算公式如下：
黴菌數（％）＝陽性視野數/50×100％
舉例如圖18-6：記錄的陽性視野數，片1為15，片2為16，則樣品的黴菌數為：
樣品黴菌數（％）＝（15＋16）/50×1/2×100％＝31％
實驗要注意下述三個問題：
6.1 番茄醬黴菌數指標
部頒標準為陽性視野不超過40％，在國際貿易中，合同上無要求時按部頒標準執行，合同上有要求時按合同執行。
6.2 製片數量
每抽取一罐樣品製兩個片子，每片觀察50個視野，如果超過標準指標，應該繼續製片，但片子數量不得少於3片即150個視野，如果計測結果相近時，可取其平均值。
6.3 複檢數量
如對抽樣結果有異議，，應加倍抽樣。全部合格，作為合格處理，其中有一罐不合格，該批作為不合格處理。
五 報告要求
作好計測記錄，按記錄計算計測結果並作報告
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