實驗——誌賀氏菌屬（Shigella）檢驗

1 目的

1.1 了解誌賀氏菌屬係統檢驗原理

1.2 理解誌賀氏菌屬生化反應原理

1.3 掌握誌賀氏菌屬係統檢驗方法

2 原理

誌賀氏菌屬的細菌，又稱為痢疾杆菌。能引起痢疾症狀的病原微生物很多，如誌賀氏茵屬、沙門氏茵屬、變形杆菌屬、埃希氏菌屬等，還有阿米巴原蟲、鞭毛蟲及病毒等，其中以誌賀氏菌引起的細菌性痢疾最為常見。人類對誌賀氏菌的易感性較高，所以在食物和飲用水的衛生檢驗時，常以是否含有誌賀氏茵作為指標。

與腸杆菌科各屬細菌相比較，誌賀氏菌屬的主要鑒別特征為不運動，對各種糖的利用能力較差，並且在含糖的培養基內一般不形成可見氣體。除運動力與生化反應外，誌賀氏菌的進一步分群分型有賴於血清學試驗。

3 材料

3.1 菌種

某種誌賀氏菌（Shigella sp.

大腸埃希氏菌（E. coli）

3.2 檢樣

食品檢樣

3.2 培養基及試劑

CN增菌液、HE瓊脂、SS瓊脂、伊紅美藍瓊脂（EMB）、麥康凱瓊脂、三糖鐵瓊脂（TSI）、半固體肉湯蛋白腖試管、賴氨酸脫羧酶試驗培養基、苯丙氨酸培養基、西蒙氏檸檬酸瓊脂、葡萄糖銨瓊脂、葡萄糖半固體、緩衝葡萄糖蛋白陳水、糖發酵管（棉籽糖，甘露糖，甘油，七葉苷及水楊苷）、5%乳糖發酵管、蛋白腖水、尿素瓊脂。

氰化鉀（KCN）、吲哚試劑、加基紅試劑，V-P試劑、氧化酶試劑、誌賀氏菌屬診斷血清。

3.4 器具

天平（稱取檢樣用）、均質器和乳缽、溫箱、顯微鏡、滅菌光口瓶、滅菌三角瓶、滅菌平皿、載玻片、酒精燈、滅菌金屬匙或玻璃棒、接種棒、鎳鉻絲、試管架、試管簍、硝酸纖維素濾膜。

4 流程

 

5 步驟

5.1 增菌

稱取檢樣25g，加入裝有225mLGN增菌液的500mL廣口瓶內，固體食用均質器以8 000～10 000r/m打碎1min，或用乳缽加滅菌砂磨碎，粉狀食品用金屬匙或玻璃棒研磨使其乳化，於36℃培養6～8h，培養時間視細菌生長情況而定，當培養液出現輕微混濁時即應終止培養。

5.2 分離

取增菌液1環，劃線接種於HE瓊脂平板或SS瓊脂平板1個；另取1環劃線接種於麥康凱瓊脂平板或伊紅美藍瓊脂平板1個，於36℃培養18～24h，誌賀氏菌在這些培養基上呈現無色透明不發酵乳糖的菌落。

5.3 生物化學試驗

   挑取乎板上的可疑菌落，接種在三糖鐵瓊脂和半固體各一管。一般應多挑幾個茵落

以防遺漏。誌賀氏茵屬在三糖鐵瓊脂內的反應結果為底層產酸，不產氣(福氏誌賀氏茵

6型可微產氣)，斜麵產堿，不產生硫化氫；半固體管內沿穿刺線生長，無動力，具有以

上特性的菌株，疑為誌賀氏菌，可做血清學凝集試驗。

    在做血清學試驗的同時，應同時做苯丙氨酸脫氨酶、賴氨酸脫羧酶、西蒙氏

檸檬酸鹽和葡糖胺、尿素、KCN、水楊苷、七葉苷試驗，誌賀氏茵屬均為陰性反應。必要時應做革蘭氏染色檢查和氧化酶試驗，應為氧化酶陰性的革蘭氏陰性杆菌。並用生化試驗方法做4個生化群的鑒定。見表5-1

表5-1 誌賀氏菌屬四個群的生化特性

注：＋陽性；－陰性；－/＋多數陰性，少數陽性；（＋）遲緩陽性；d有不

5.4 血清學分型

挑取三糖鐵瓊脂上的培養物，做玻片凝集試驗。先用4種誌賀氏菌多價血清檢查。如果由於K抗原的存在而不出現凝集，應將菌液煮沸後再檢查；如果呈現凝集，則用A1、A2、B群多價和D群血清分別試驗。如係B群福氏誌賀氏菌，則用群和型因子血清分別檢查。福氏誌賀氏菌各型和亞型的型和群抗原見表5-2。可先用群因子血清檢查，再根據群因子血清出現凝集的結果，依次選用型因子血清檢查（表5-3）。

表5-2  福氏誌賀氏菌各型和亞型的型抗原和群抗原

注：＋凝集；－不凝集；（）有或無。

6 結果

根據實驗過程詳細記錄樣品和對照菌種的各項結果，並做出結論報告。

7 思考

7.1 如何檢出食品中的誌賀氏菌？

7.2 根據培養和生化試驗，有否檢出誌賀氏菌？

7.3 根據生化特性和血清學試驗，檢出的誌賀氏菌屬哪個群？哪個型？