1 目的
1.1 了解肉毒梭菌的生長特性和產毒條件。
1.2 掌握肉毒梭菌及其毒素檢驗原理和方法。
2 原理
肉毒梭菌廣泛存在於自然界，引起中毒的食品有臘腸、火腿、魚及魚製品和罐頭食品等。在美國以罐頭發生中毒較多，日本以魚製品較多，在我國主要以發酵食品為主，如臭豆腐、豆瓣醬、麵醬、豆豉等。檢驗食品，特別是不經加熱處理而直接食用的食品中有無肉毒毒素或肉毒梭菌（例如罐頭等密封性保存的食品），至為重要。
肉毒梭菌為專性厭氧的革蘭氏陽性杆菌，芽孢卵圓形、近端位，在庖肉培養基中生長時，混濁、產氣、發臭、能消化肉渣。
肉毒梭菌按其所產毒素的抗原特異性分為A、B、C、D、E、F、G等七個型。除G型菌之外，其它各型菌分布相當廣泛。我國各地發生的肉毒中毒主要是A型和B型菌。E型和C型菌也發現過肉毒中毒。至於D型和F型菌，我國尚未見到由此而發生的肉品中毒事件。
肉毒梭菌檢驗目標主要是毒素，不論食品中的肉毒毒素檢驗還是肉毒梭菌檢驗，均以毒素的檢測及定型試驗為判定的主要依據。
3 材料
3.1 樣品
罐頭食品，豆類、穀類等發酵食品。
3.2 菌種
肉毒梭狀芽孢杆菌（Clostridium botulinum）
某種梭狀芽孢杆菌（Clostridium sp.）
3.3 培養基與試劑
庖肉培養基；卵黃瓊脂培養基；明膠磷酸鹽緩衝液；肉毒分型抗毒診斷血清；胰酶（活力1:250）；革蘭氏染色液。
3.4 其它
離心機和離心管；均質器；恒溫箱，顯微鏡，厭氧培養裝置（常溫催化除氧式或堿性焦性沒食子酸除氧式）；吸管，注射器，接種，載玻片，小白鼠等。
4 流程
5 步驟
5.1 樣品處理
液體樣品直接接種，固體或半固體樣品加入等量明膠磷酸鹽緩衝液研碎後接種。
5.2 培養增菌
5.2.1 增菌培養
取庖肉培養基5支，分別標記1～5號，煮沸10～15min後，做如下處理：
1號：急速冷卻，接種檢樣均質液1～2ml。
2號：冷卻至60℃，接種檢樣均質液1～2ml，繼續於60℃保溫10min，急速冷卻。
3號：接種檢樣均質液1～2ml，繼續煮沸加熱10min，急速冷卻。
4號：急速冷卻，接種肉毒梭菌菌種。
5號：急速冷卻，作為空白對照。
以上5支試管於30℃厭氧培養5d，若無生長，再培養10d，到期無生長，即可報告“未發現肉毒梭菌”。若有生長，取培養物進行離心（300rpm，15min），上清液做毒素檢測，沉澱用於分離培養。
5.3 毒素檢測
5.3.1 製備注射液
用上述培養物的上清液製備5組注射液。
①上清液不做任何處理。
②胰酶激活處理液，即上清液9ml加1％胰酶（活力1:250）水溶液1ml，37℃保溫60min，不時攪動。
③胰酶激活處理液1ml，加入1ml多型混合肉毒抗毒診斷血清，混勻後37℃保溫，作用30min。
④胰酶激活處理液1ml，加入1ml明膠磷酸鹽緩衝液，混勻後煮沸10min。
⑤胰酶激活處理液1ml，加入1ml明膠磷酸鹽緩衝液，混勻即可。
5.3.2腹腔注射
每組2隻小白鼠（體重為15～20g）分別注射上述①～⑤號注射液，每隻腹腔注射0.5ml。另以2隻小白鼠作為對照，每隻腹腔注射經滅菌的明膠磷酸鹽緩衝液0.5ml。對各組小白鼠以相同條件精心飼養，觀察4d。
5.2.2檢出試驗
注射液中若有毒素存在，小白鼠一般多於24h之內發病死亡。主要症狀為豎毛、四肢癱軟、呼吸困難、呼吸呈風箱式、腰部凹陷、宛若蜂腰，最終死於呼吸麻痹。
肉毒毒素是一種蛋白質，分為有活性和無活性兩種狀態，非活性的肉毒毒素可被胰酶激活而具毒性。因此，①組動物存活，而②組死亡，仍能說明上清液中可能含有肉毒毒素。
5.2.3 證實試驗
③組～⑤組為毒素檢測的確證試驗。若③組、④組動物均獲得保護性存活，僅⑤組小白鼠以特有症狀死亡則可以判定培養液中有肉毒毒素存在。必要時應進行毒素定型試驗，並測定檢樣中肉毒毒素的毒力。
5.3 分離培養
5.3.1 分離培養
選取經毒素檢測試驗證實含有肉毒毒素的前述增菌培養物的沉澱物，加無菌生理鹽水稀釋至原體積（必要時可選適宜的加熱處理方式重複一次），取菌液劃線接種卵黃瓊脂平板，35℃厭氧培養48h。肉毒梭菌在卵黃瓊脂平板上生長時，菌落及其周圍培養基表麵覆蓋著特有的虹彩樣（或珍珠層樣）薄層，但G型菌無此現象。
5.3.2 產毒培養
根據菌落形態及染色鏡檢菌體形態，挑取可疑菌落接種於庖肉培養基，於30℃培養5d，進行培養特征檢查確證試驗。
5.3.3 培養檢查
取庖肉培養液接種卵黃瓊脂平板兩塊，分別在需氧和厭氧條件下，於35℃培養48h，觀察生長情況及菌落形狀。肉毒梭菌隻有在厭氧情況下才能在卵黃瓊脂平板上生長並形成具有上述特性的菌落，而在需氧條件下則不生長。
6 結果
詳細記錄試驗過程和現象，按記錄結果報告樣品檢驗結論。
7 思考
7.1 肉毒梭菌有無芽孢？是需氧菌還是厭氧菌？
7.2 肉毒梭菌引起的食物中毒是感染型還是毒素型食物中毒？兩者有何區別？
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