實驗——微生物的分離、純化

1 目的

1.1 了解微生物分離和純化的原理

1.2 掌握常用的分離純化微生物的方法

2 原理

從混雜微生物群體中獲得隻含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物分離與純化。平板分離法普遍用於微生物的分離與純化。其基本原理是選擇適合於待分離微生物的生長條件，如營養成分、酸堿度、溫度和氧等要求,或加入某種抑製劑造成隻利於該微生物生長，而抑製其他微生物生長的環境，從而淘汰一些不需要的微生物。

微生物在固體培養基上生長形成的單個菌落，通常是由一個細胞繁殖而成的集合體。因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養。獲取單個菌落的方法可通過稀釋塗布平板或平板劃線等技術完成。值得指出的是，從微生物群體中經分離生長在平板上的單個菌落並不一定保證是純培養。因此，純培養的確定除觀察其菌落特征外，還要結合顯微鏡檢測個體形態特征後才能確定，有些微生物的純培養要經過一係列分離與純化過程和多種特征鑒定才能得到。

土壤是微生物生活的大本營，它所含微生物無論是數量還是種類都是極其豐富的。因此土壤是微生物多樣性的重要場所，是發掘微生物資源的重要基地，可以從中分離、純化得到許多有價值的菌株。本實驗將采用不同的培養基從土壤中分離不同類型的微生物。

3 材料

3.1  培養基  

澱粉瓊脂培養基(高氏I號培養基)，牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基，馬丁氏瓊脂培養基，查氏瓊脂培養基。

3.2  溶液或試劑  

10%酚液，盛9ml無菌水的試管，盛90ml無菌水並帶有玻璃珠的三角燒瓶，4%水瓊脂。

3.3  儀器或其它用具

無菌玻璃塗棒，無菌吸管，接種環，無菌培養皿，鏈黴素和土樣，顯微鏡，血細胞計數板、塗布器等。

4 流程

倒平板→製備梯度稀釋液→塗布（或劃線法）→培養→挑單菌落→保存。

5 步驟

5.1  稀釋塗布平板法

5.1.1  倒平板

將牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基、高氏I號瓊脂培養基、馬丁氏瓊脂培養基加熱溶化待冷至55～60℃時，高氏I號瓊脂培養基中加入10%酚數滴，馬丁氏培養中加入鏈黴素溶液(終濃度為30μg/ml)，混合均勻後分別倒平板，每種培養基倒三皿。

倒平板的方法：右手持盛培養基的試管或三角瓶置火焰旁邊，用左手將試管塞或瓶塞輕輕地撥出，試管或瓶口保持對著火焰；然後左手拿培養皿並將皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒人培養基約15ml，加蓋後輕輕搖動培養皿，使培養基均勻分布在培養皿底部，然後平置於桌麵上，待凝後即為平板。

5.1.2  製備土壤稀釋液

稱取土樣l0g，放入盛90ml無菌水並帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振搖約20min，使土樣與水充分混合，將細胞分散。用一支lml無菌吸管從中吸取1ml土壤懸液加入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻，然後用無菌吸管從此試管中吸取lml(無菌操作見圖-2)加入另一盛有9ml無菌水的試管中，混合均勻，以此類推製成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀釋度的土壤溶液，注意：操作時管尖不能接觸液麵，每一個稀釋度換一支試管。 

5.1.3  塗布

將上述每種培養基的三個平板底麵分別用記號筆寫上10^-4、10^-5和10^-6三種稀度，然後用無菌吸管分別由10^-4、10^-5和10^-6 三管土壤稀釋液中各吸取0.1或0.2ml，小心地滴在對應平板培養基表麵中央位置用無菌玻璃塗棒按圖4-2所示，右手拿無菌塗棒平放在平板培養基表麵上，將菌懸液先沿同心圓方向輕輕地向外擴展，使之分布均勻。室溫下靜置5～l0min，使菌液浸入培養基。

5.1.4  培養

將高氏I號培養基平板和馬丁氏培養基平板倒置於28℃溫室中培養3～5d，肉膏蛋白腖平板倒置於37℃溫室中培養2～3d。

5.1.5  挑菌落     

將培養後長出的單個菌落分別挑取少許細胞接種到上述三種培養基斜麵上(圖4-1 C)，分別置28℃和37℃溫室培養。若發現有雜菌，需再一次進行分離、純化，直到獲得純培養。

5.2  平板劃線分離法

5.2.1  倒平板

按稀釋塗布平板法倒平板，並用記號筆標明培養基名稱、土樣編號和實驗日期。

5.2.2  劃線

在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環，挑取上述10-l的土壤懸液一環在平板上劃線(圖4-3)。劃線的方法很多，但無論采用哪種方法，其目的都是通過劃線將樣品在平板上進行稀釋，使之形成單個菌落。常用的劃線方法有下列二種：用接種環以無菌操作挑取土壤懸液一環，先在平板培養基的一邊作第一次平行劃線3～4條，再轉動培養皿約70度角，並將接種環上剩餘物燒掉，待冷卻後通過第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同樣的方法通過第二次劃線部分作第三次劃線和通過第三次平行劃線部分作第四次平行劃線(圖4-4)。劃線完畢後，蓋上培養皿蓋，倒置於溫室培養。

5.2.3  挑菌落 

同稀釋塗布平板法，一直到分離的微生物認為純化為止。

5.2.5  結果判定

所做塗布平板法和劃線法是否較好地得到了單菌落？如果不是，請分析其原因並重做。