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家庭組織培養建議——操作



錄入時間:2011-4-14 14:01:34 來源:中國組培網

1.培養容器和玻璃儀器的準備:
  進行培養基的配製首先要準備好培養瓶和配製使用的玻璃儀器。培養瓶一般使用各種果醬瓶,要先用洗潔精浸泡瓶子4~8小時,再用流水衝洗數次。其他的玻璃儀器同樣需要這樣清潔,直到玻璃壁上不掛水珠而是成為水膜為止。清洗完畢的玻璃容器要倒扣,空去瓶內的水。
  清洗幹淨的容器要注意防塵,盡量放置在玻璃櫃中。更簡單的是用幹淨的毛巾將容器蓋住。
  移液管要用吸球來清洗,反複用蒸餾水吹吸直到潔淨為止,將移液管放置在一個長筒中,便於使用。一般移液管隻能使用一次,即要清洗,所以有多必要準備幾隻移液管,建議:10ml/2支,5ml/2支,1ml/5支。
  2.培養基的配製:
  經典的組織培養用培養基是ms配方,其基本上劃分為:大量元素、微量元素、鐵鹽、有機複合物、植物激素、糖和支持物。這些成分的用量都在毫克級,用普通天平是難以稱量的,為了解決這個問題,我們可以按比例放大各成分的用量配製成母液,使用的時候按一定比例加入即可。
  下麵將一種ms培養基的母液配製方案公布如下:
  大量元素:硝酸銨66.0克;
  硝酸鉀76.0克;
  無水氯化鈣13.3克;
  七水硫酸鎂14.8克;
  磷酸二氫鉀6.8克。
  以上分別溶解後合並定容到1升,每配製1升標準ms培養基取25毫升。
  鐵鹽:七水硫酸亞鐵5.56克;
  乙二胺四乙酸二鈉(edtana)7.46克。
  以上兩種分別加熱溶解,混合,定容到1升,調整ph到5.5以下,每配製一升ms取5毫升。
  微量元素和有機複合物的用量過於微小,為了簡便我們可以用蔬菜提取液或者馬鈴薯提取液代替。通常我們習慣用100克菠菜加100ml的水煮沸10分鍾,過濾留濾液,每配製1升ms培養基加入20~50毫升提取液。同樣也可以使用帶皮馬鈴薯100克加200毫升水煮沸15分鍾,過濾留濾液,每升ms加入50~100毫升即可。
  加入上述各組分後,每升ms培養基還需要加入白砂糖30克,瓊脂7克。
  這裏要說明的是,糖和瓊脂都是可變的量,要根據需要調整。另外製作果凍用的卡拉膠也可以代替瓊脂,透明度更好。
  上述各成分加入後,定容到800毫升左右,用微波爐加熱,直到瓊脂全部溶解為止。此時加入所需的植物激素(通常配製成0.1%溶液,這樣每取1毫升,換算到培養基中就是1ppm)。然後加水定容到1100毫升(1.1升),之所以多出0.1升是為了抵消分裝和消毒中的損耗。最後用酸堿調整ph到5.8~6.0。
3.使用ms原粉配製培養基:
  目前國內的一些化學品公司開發了簡便的ms培養基原粉,大大簡便了培養基的配製,根據不同公司的說明選擇培養基的種類。下麵就以ms原粉為例: ms培養基原粉,包括了大量元素、微量元素、鐵鹽、有機複合物、糖和瓊脂,一般按使用方法稱量,微波爐加熱溶解,加入激素,定容到1100毫升(1.1升),調整ph值到5.8~6.0。 
 4.分裝:
  將配製好的培養基分裝在培養容器中,注意要趁熱分裝,因為瓊脂在40度以下就會凝固。每個培養瓶裝培養基大約是瓶容積的1/6~1/5,注意不要將培養基掛在瓶的外壁,這樣容易造成汙染。分裝後用聚丙烯薄膜或著方便麵的袋子封口,用膠圈固定(膠圈盡量選擇自行車的內胎,這種膠圈比較耐熱)。
 5. 滅菌:
  采用家庭壓力鍋消毒,建議到醫療器械用品商店買一些“滅菌效果試紙”,它們可以指示滅菌效果,當滅菌達到效果時會變色。把試紙和培養基同時放入鍋內,加熱到有大量蒸汽冒出,再加上壓力伐,維持小火30~40分鍾。
    滅菌完畢後自然冷卻,將培養基取出,放在陰涼無塵處備用。
 6. 接種箱的準備:
  新製作的接種箱必須要清潔幹淨,盡量做到無死角。每次使用前2小時,將操作所需要的全部物品放入接種箱,再用一個小燒杯加入3~5克高錳酸鉀放入接種箱內,在箱內向燒杯中倒入2~3毫升的甲醛溶液,大約幾秒鍾後會看到甲醛蒸汽出現,這樣可以對接種箱內的所有物品進行初次消毒;同時打開紫外線燈照射。紫外線燈是高電壓穿激汞蒸汽產生的,紫外線進行第二道滅菌,在紫外線照射大約15分鍾後,會激發氧氣形成臭氧,臭氧作為第三道滅菌防線,這樣經過三次滅菌,接種箱基本上可以達到無菌標準。
  在操作前15分鍾內,向剛才蒸發甲醛用的燒杯中倒入5毫升濃氨水,因為甲醛對人體有毒害作用,氨水可以和甲醛形成一種叫做“六亞甲基四胺”的固體物質,從而中和了甲醛的刺激性蒸汽。這個時候紫外燈不要關掉,要繼續照射,直到操作前5分鍾關閉,維持黑暗5分鍾,然後再打開日光燈進行操作。維持5分鍾黑暗的原因是,紫外光對微生物的殺滅是作用於dna的胸腺嘧啶,形成四聚體,但是微生物具有一種光複活蛋白,可以在有可見光的環境下還原胸腺四聚體,而使微生物複活,這個作用叫做“光複活作用”,所以在關掉紫外燈後必須維持黑暗幾分鍾,避免光複活作用的出現。

 

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