1 主題內容與適用範圍
本方法規定了生活飲用水中總大腸菌群的濾膜測定方法。
本方法適用於生活飲用水和低濁度的水源水中總大腸菌群數的測定。
2 方法提要
用孔徑為0.45μm的微孔濾膜過濾水樣，細菌被截留在濾膜上，將濾膜貼在選擇性培養基上，經培養後，計數生長在濾膜上的典型大腸菌群菌落數。
3 培養基與試劑
3.1 品紅亞硫酸鈉培養基
3.1.1 成份
A 蛋白腖 10g
B 酵母浸膏 5g
C 牛肉膏 5g
D 乳糖 10g
E 瓊脂 15~20g
F 硫酸氫二鉀 3.5g
G 無水亞硫酸鈉 5g左右
H 堿性品紅乙醇溶液(50g/L) 20mL
I 蒸餾水 1000mL
3.1.2 儲存培養基的製備
先將瓊脂加到500mL蒸餾水中，煮沸溶解，於另500mL蒸餾水中加入硫酸氫二鉀、蛋白腖、酵母浸膏和牛肉膏，加熱溶解，倒入已溶解的瓊脂，補充蒸餾水至1000mL，混勻後調pH為7.2~7.4，再加入乳糖，分裝，115℃高壓滅菌20min，儲存於冷暗處備用。
3.1.3 平皿培養基的配製
將上法製備的儲存培養基加熱融化，用滅菌吸管按比例吸取一定量的5％堿性品紅乙醇溶液置於滅菌空試管中，再按比例稱取所需的無水硫酸鈉置於另一滅菌試管中，加滅菌水少許，使其溶解後，置沸水浴中煮沸10min以滅菌。
用滅菌吸管吸取已滅菌的亞硫酸鈉溶液，滴加於堿性品紅乙醇溶液至深紅色退成淡粉色為止，將此亞硫酸鈉與堿性品紅的混合液全部加到已融化的儲存培養基內，並充分混勻(防止產生氣泡)，立即將此種培養基15mL傾入已滅菌的空平皿中。待冷卻凝固後置冰箱內備用。此種以製成的培養基於冰箱內保存不宜超過二周。如培養基已由淡粉色變為深紅色，則不能再用。
3.2 乳糖蛋白腖培養基
3.2.1 成份
A 蛋白腖 10g
B 牛肉膏 3g
C 乳糖 5g
D 氯化鈉 5g
E 溴甲酚紫乙醇溶液(16g/L) 1mL
F 蒸餾水 1000mL
3.2.2 製法
將蛋白腖、牛肉膏、乳糖及氯化鈉溶於蒸餾水中，調整pH為7.2~7.4，再加入1mL1.6％溴甲酚紫乙醇溶液，充分混勻，分裝於裝有倒管的試管中，115℃高壓滅菌20min，貯存於冷暗處備用。
4 儀器
4.1 濾器。
4.2 濾膜，孔徑0.45~0.65μm。直經根據濾器規格，目前常用的有3.5cm和4.7cm兩種。
4.3 抽濾設備。
4.4 無齒鑷子。
4.5 培養箱: 36±1℃。
4.6 冰箱: 0~4℃。
4.7 天平。
4.8 顯微鏡。
4.9 平皿: 直徑為9cm。
4.10 滅菌刻度吸管: 1mL,10mL。
5 檢驗步驟
5.1 準備工作
5.1.1 濾膜滅菌:
將濾膜放入燒杯中，加入蒸餾水，置於沸水浴中煮沸滅菌三次，每次15min。前兩次煮沸後需更換水洗滌2~3次，以除去殘留溶劑。
5.1.2 濾器滅菌: 用點燃的酒精棉球，火焰滅菌。也可用121℃高壓滅菌20min。
5.2 過濾水樣
用無菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣部分，將粗糙麵向上，帖放在已滅菌的濾床上、，固定好濾器，將100mL水浴(如水樣含菌數較多，可減少過濾水樣量，或將水樣稀釋)注入濾器中，打開濾器閥門，在負0.5大氣壓下抽濾。
5.3 培養
水樣濾完後，再抽氣約5s，關上濾器閥門，取下濾器，用滅菌鑷子夾取濾膜邊緣部分，移放在品紅亞硫酸鈉培養基(36.1.3.1)上，濾膜截留細菌麵向上，濾膜應與培養基完全貼緊，兩者間不得留有氣泡，然後將平皿倒置，放入37℃恒溫箱內培養22~24h。
6 觀察結果
6.1 挑出符合下列特征菌落進行革蘭氏染色、鏡檢。
紫紅色，具有金屬光澤的菌落。
深紅色，不帶或略帶金屬光澤的菌落。
淡紅色，中心色較深的菌落。
6.1.1凡革蘭氏染色為陰性的無芽胞杆菌，再接種乳糖蛋白腖培養基液，於37℃培養24h，有產酸產氣者，則判定為總大腸菌群陽性。
6.1.2 計算濾膜上生長的總大腸菌群數，以每100mL
總大腸菌群菌落數(CFU/100mL)＝水樣中的總大腸菌群數報告之(CFU/100mL)/ 過濾的水樣體積(mL)
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