伴放線放線杆菌菌落生長形態變化的觀察

【 摘要】   目的  觀察伴放線放線杆菌( Actinobacillus  actinomycetemcomitans，Aa) 從粗糙型到光滑型的轉變過程，識別An在實驗室傳代過程中出現的不同生長形態。方法從牙周炎患者齦下菌斑中分離出的原代菌株8株，應用固體及液體培養基連續傳代，液體培養每次傳代的同時接種固體培養基觀察相應的菌落形態。結果液體培養獲得3株光滑型轉變株。菌落的變化從粘附的小菌落到沉澱的大菌落到完全的均勻生長，轉化過程大約需要7～8代。在這一過程中相應傳至固體培養基上生長的從粘附的半透明的小菌落變大、不透明並失去粘附的特性，又隨著邊緣的擴散變為扁平，透明度也增加；與此同時內部的星形結構逐漸變簡單、變小，最後消失。固體培養未獲得典型的轉變株。結論An從粗糙型到光滑型的轉變是一個菌落濕度逐漸增加，體積逐漸增大，並逐漸失去內部結構的過程。這一過程至少可以看到半透明突起的粗糙型、不透明突起的光滑型和近乎透明的扁平光滑型3種菌落形態。

【關鍵詞】 放線杆菌，伴放射菌；形態發生；牙周炎；牙菌斑

 

伴放線放線杆菌( Actinobacillus actinomycetemcomitans，Aa ) 是一種革蘭陰性的球杆菌，嗜二氧化碳、微氧或厭氧環境生長^［1］。Aa可以引起一些嚴重的全身感染，如心內膜炎、心包炎、腦膿腫、腦膜炎、骨髓炎、甲狀腺膿腫及泌尿係感染等^［2］。目前有多方麵的證據表明Aa與牙周病之間的相互關係，特別是侵襲 性 牙周 炎。1999年美國牙周病學會公布的新的牙周病分類標準將Aa列為侵襲性牙周炎的實驗室參考診斷指標^［3］。

在體外培養中，Ao至少可以觀察到兩種主要形態^［4］。從齦下菌斑中新分離出的菌落形態為粗糙型，典型的表型特征是菌落突起、灰白、半透明、內部呈星形結構；在體外長期傳 代培養的菌落則為光滑型、不粘附、內部無星形結構。菌落形態的差異一般伴隨細菌表麵結構及成分的不同，進而可能影響到細菌致病性的變化^［？］。我們在伴放線放線杆菌早期進行的分離培養研究中也注意到這種形態差異。同時在最近的研究中發現，Aa在實驗室傳代過程中形態變化很大，從粗糙型到光滑型的轉變過程中還存在中間形態，如果不熟悉這些特 點，往往誤以為是其他的汙染菌而放棄繼續傳代。所以熟悉Aa的形態學變化無論對於臨床診斷還是實驗室研究都是最基本、最重要的一步。我們通過對Aa臨床菌株從粗糙型到光滑型轉變的連續觀察，認識和描述Aa在實驗室生長的不同形態特點，為Aa鑒定及Aa與牙周病關係研究中實驗菌株的選擇提供參考。

 

材料與方法

1． 菌株：①實驗室參考菌株：Aa  ATCC43718，ATCC33384。②臨床菌株：伴放線放線杆 菌M1-5，M1-1，M2-4，M2-2，M3-1，M3-5，C6-1，C6-2分離自2例牙周炎患者。以上菌種均由日本鶴見大學齒學部細菌室提供。粗糙型菌株均為固體培養第2代凍存菌株。

2． 細菌的培養：應用Aa TSBV選擇性培養基複蘇凍存的粗糙型菌株，挑取一典型菌落，分別接種固體和液體的培養基。固體培養基4d傳代1次，液體培養基1～2 d傳代1次。液 體培養每次傳代前充分震蕩，分別取一接種環接種固體及液體培養基。

3． 細菌的鑒定：粗糙型菌株根據TSBV培養基上生長，粘附，內部呈星形結構，觸酶陽性及PCR鑒定。轉變後的菌株主要根據TSBV培養基上生長，觸酶陽性，PCR鑒定及SDS- PAGE鑒定。

4． PCR：選擇伴放線放線杆菌16SrRNA引物5′- GTTAGCCCTGGTGCCCGAAG一3′和5′- TGACGGGCGGTGTGTACAAGG-3′。PCR循環：預變性95℃ 3min，變性95℃ 1min，複性55℃1min，延伸72℃1 min，最後延伸72℃ 10 min^［6］。

5． SDS．PAGE：樣品加入等量的樣品緩衝液0．125 mol／L Tris-HC1( pH 6．8 )，4％SDS，20％甘油，10％巰基乙醇，100℃加熱5min。電泳膠濃度為15％。結果觀察用0．025％的考馬斯亮藍染色。

 

結  果

1．通過液體傳代10次左右，從粗糙型菌株 M2-4、M3-5、 C6-2獲得3株光滑型轉變株， 分別命名為M2-4 S、M3-5S、C6-2S。其他菌株處於不同的轉化階段。菌株的全細胞SDS．P AGE鑒定3株粗糙型菌株及相應的3株轉變株與實驗室參考菌株ATCC43718及ATCC3338 4蛋白帶型一致。

2．伴放線放線杆菌生長的形態學變化的規律： 

(1) 原代菌株：An從齦下菌斑中新分離出的細菌菌落灰白，半透明，突起，菌落一般比較小，比較緊密，內部呈星形結構。固體培養菌落緊緊粘附到培養基表麵，液體傳代菌落粘附到管壁上生長，液體清亮。

(2) 液體培養菌株的轉變：最初的變化是菌落沉澱生長，隨著傳代次數的增加菌細胞量明顯增多，但液體仍保持清亮。大約經過7～8代，細胞開始均勻生長，沉澱的細胞量開始減少。一般經過10代左右細胞完全轉化成均勻生長，繼續傳代不再發生變化。不同菌株之間轉化快慢存在差異。    

(3)液體傳代固體培養觀察菌落的變化過程：主要有兩步。第一步菌落突起變大，顏色加深，在固體培養基上的粘附性明顯降低， 內部星狀結構趨於簡單不典型至逐漸變小呈橄欖形或三角形或完全消失。第二步菌落邊緣逐漸擴散，菌落形態可以形成草帽狀，內部可能僅留一臍狀結構，最終臍狀結構會完全消失。完全擴散開後菌落呈扁平、濕潤、半透明或近乎透明狀。   

(4) Aa菌落內部星狀結構變化與Aa在固體與液體培養條件下的生長特點見。

 

討  論

1990年Inouye等^［7］最早報道Aa存在3種菌落形態，包括半透明的粗糙型和光滑型、不透明的光滑型。半透明的粗糙型內部存在星形結構，反複傳代可產生兩種菌落形態，即半透明和不透明的光滑型。 並發現半透明的光滑型可產生不透明的光滑型，但是不透明光滑型不產生半透明光滑型。這些菌落的粘附生長情況也不同。半透明的粗糙型及光滑型緊密粘附平板或試管壁長，不透明光滑型不粘附，液體培養也呈均勻生長。我們在實驗中動態觀察了Aa的形態學變化，發現從粗糙型轉變成完全的扁平光滑型主要有兩步：首先菌落逐漸增大，內部結構趨於簡單，其透光度從半透明到不透明，顏色也從灰白到桔黃；隨著菌落濕度的增大，菌落逐漸從邊緣放開，由突起逐漸變扁平，透光度也逐漸增加。總結這種變化也主要包括了3種菌落形態，半透明的粗糙型、作為中間形態的不透明的光滑型，及作為最終形態的半透明或近乎透明的光滑型。本研究表明，菌落透明度的變化可能主要與菌落的大小及突起狀況有關，從粗糙型到光滑型，菌落從小到大，但最初是突起變大，菌落透光度小了，外觀自然從半透明變為不透明。隨著菌落的放開、變平，菌落又逐漸變為半透明或近乎透明。所以不透明的光滑型實際是一種中間形態，在這種形態下，菌落逐漸濕潤，不粘附或至少是粘附性降低了。

Haase等^［8］最近描述了Aa液體培養的形態學變化。Aa經曆從自動凝集的小顆粒的粘附生長、大顆粒的半沉澱生長、完全沉澱生長、少量的沉澱但主要是均勻生長、到最終變為均勻生長的過程。在開始均勻生長之前，液體一直是清亮的。我們觀察這種液體的形態學變化與固體培養的形態學變化是一致的。菌落開始變大突起，粘附性降低，表現在液體中自然是沉澱生長並且量也多， 因菌落還是凝集生長並未放開， 所以液體清亮。到菌落完全放 開生長後液體均勻，不再出現沉澱。

Aa從粗糙型到光滑型的轉變有一個過程。一般液體培養較容易發生轉變，大約l0代左 右。在我們的研究中，單純固體傳至20多代雖然有的菌株星形結構已不典型，粘附不明顯，但還未轉變成光滑型。與液體培養基相比，固體培養可能需要足夠長的時間才能發生完全的轉變。

細菌可以存在時相的變化，如一些腸道細菌^［9］。但到目前為止，尚未見到Aa從光滑型轉化成粗糙型的報道。在我們的研究中， Aa可以從粗糙型轉變成光滑型，但轉化成光滑型後固體及液體繼續傳代培養均未發現進一步的變化。另外光滑型比粗糙型菌株更容易生長，具有更強的生長活力。

Aa形態學鑒定主要根據其粘附和內部的星形結構，但光滑型的兩種類型均不具有這些特點，在轉化過程中往往很難判定是轉化菌還是汙染菌，所以我們應用了16 S rRNA  PCR及全細胞蛋白SDS．PAGE等方法監測轉化過程和鑒定轉化結果。

粘附是細菌致病的一個重要特點，特別是在口腔存在唾液流動的環境中粘附定居是細菌致病的第一步。Aa粗糙型體外培養粘附生長，是否比光滑型具有更強的致病性還需要進一步研究。細菌的致病性是相對的，致病因子的表達也需要一定條件。體外培養菌株由於條件的變化某些致病特點可能不典型或消失。我們在最近的試驗中也觀察到，粗糙型菌株存在豐富的菌毛，而光滑型菌株菌毛少或消失，一般認為菌毛是細菌直接參與粘附的一個重要粘附因子^［10］；另外粗糙型和光滑型菌株外膜蛋白也存在很大差異。這些變化提示細菌致病性的可能變化，應進一步從分子水平上探討A a表型變化對其致病性的影響。     

表1  Aa菌落內部星狀結構變化與Aa在固體與液體培養條件下的生長特點

作者：王者玲 Nobuko  Maeda  Tomoko  Ohshima  Ayako  Takao 楊聖輝  李金路《中華口腔醫學雜誌》