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藥敏試驗操作



錄入時間:2011-4-21 13:46:44 來源:中華檢驗醫學網

實驗步驟
一、實驗材料
 
  普通營養瓊脂培養基:可去生化試劑店購買,做不同細菌的藥敏試驗可選擇不同的培養基,如做大腸杆菌的藥敏試驗可選擇普通營養瓊脂或麥康凱培養基。做沙門氏菌可選擇血清培養基。
  藥敏試紙:購買或自製(詳見實驗準備)
  細菌:待做藥敏試驗的細菌
  儀器:接種環、酒精燈、打孔器、牛津杯、移液器、滴頭
 
二、實驗準備
 
  2.1 藥敏片的準備:購買或自製
  2.1.1 製備方法:取新華1號定性濾紙,用打孔機打成6毫米直徑的圓形小紙片。取圓紙片50片放入清潔幹燥的青黴素空瓶中,瓶口以單層牛皮紙包紮。經15磅15-20分鍾高壓消毒後,放在37℃溫箱或烘箱中數天,使完全幹燥。
  2.1.2 抗菌藥紙片製作:在上述含有50片紙片的青黴素瓶內加入藥液0.25毫升,並翻動紙片,使各紙片充分浸透藥液,翻動紙片時不能將紙片搗爛。同時在瓶口上記錄藥物名稱,放37℃溫箱內過夜,幹燥後即密蓋,如有條件可真空幹燥。切勿受潮,置陰暗幹燥處存放,有效期3-6個月。
  2.2 藥液的製備(用於商品藥的試驗):按商品藥的使用治療量的比例配製藥液;如商品藥百病消按其說明量治療量0.01%飲水,可按這個比例配製藥液,可取10毫克加入10毫升的水中混勻。此稀釋液即為用於做藥敏試驗的藥液。
 
三、實驗操作方法
 
  3.1 藥敏片法
  3.1.1 在“超淨台”中,用經(酒精燈)火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物,以劃線方式將細菌塗布到平皿培養基上。具體方式;用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點塗菌,以每點開始劃線塗菌至平皿的1/2。然後,找到第二點劃線至平皿的1/2,依次劃線,直至細菌均勻密布於平皿。(另:可挑取待試細菌於少量生理鹽水中製成細菌混懸液,用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液塗布於平皿培養基表麵。要求塗布均勻致密)
  3.1.2 將鑷子於酒精燈火焰滅菌後略停,取藥敏片貼到平皿培養基表麵。為了使藥敏片與培養基緊密相貼,可用鑷子輕按幾下藥敏片。為了使能準確的觀察結果,要求藥敏片能有規律的分布於平皿培養基上;一般可在平皿中央貼一片,外周可等距離貼若幹片(外周一般可貼七片),每種藥敏片的名稱要記住。
  3.1.3 將平皿培養基置於37℃溫箱中培養24小時後,觀察效果。
  3.2 牛津杯法
    3.2.1 在“超淨台”中,用經(酒精燈)火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物,以劃線方式將細菌塗布到平皿培養基上。具體方式;用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點塗菌,以每點開始劃線塗菌至平皿的1/2。然後,找到第二點劃線至平皿的1/2,依次劃線,直至細菌均勻密布於平皿。(另:可挑取待試細菌於少量生理鹽水中製成細菌混懸液,用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液塗布於平皿培養基表麵。要求塗布均勻致密。)
  3.2.2 以無菌操作將滅菌的不鏽鋼小管(內徑6nm、外徑8nm、高10nm的圓形小管,管的兩端要光滑,也可用玻璃管、瓷管),放置在培養基上,輕輕加壓,使其與培養基接觸無空隙,並在小管處標記各種藥物名稱。每個平板可放4-6支小管。待分鍾後,分別向各小管中滴加一定數量的各種藥液,勿使其外溢。置37℃培養8-18小時,觀察結果。
  3.2.3 將平皿培養基置於37℃溫箱中培養24小時後,觀察效果。
  3.3 打孔法:
  該法較簡單,成本低,易操作,比較適用於商品藥物的檢測。
  3.3.1 在“超淨台”中,用經(酒精燈)火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物,以劃線方式將細菌塗布到平皿培養基上。具體方式;用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點塗菌,以每點開始劃線塗菌至平皿的1/2。然後,找到第二點劃線至平皿的1/2,依次劃線,直至細菌均勻密布於平皿。(另:可挑取待試細菌於少量生理鹽水中製成細菌混懸液,用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液塗布於平皿培養基表麵。要求塗布均勻致密。)
  3.3.2 以無菌操作將滅菌的不鏽鋼小管(外徑為4毫米、孔徑與孔距均為3毫米,管的兩端要光滑,也可用玻璃管、瓷管),放置在培養基上打孔,將孔中的培養基用針頭挑出,並以火焰封底,使培養基能充分的與平皿融合(以防藥液滲漏,影響結果)。
  3.3.3 加樣:按不同藥液加樣,樣品加至滿而不溢為止。
  3.3.4 將平皿培養基置於37℃溫箱中培養24小時後,觀察效果。
 
結果觀察
 
  在塗有細菌的瓊脂平板上,抗菌藥物在瓊脂內向四周擴散,其濃度呈梯度遞減,因此在紙片周圍一定距離內的細菌生長受到抑製。過夜培養後形成一個抑菌圈,抑菌圈越大,說明該菌對此藥敏感性越大,反之越小,若無抑菌圈,則說明該菌對此藥具有耐藥性。其直徑大小與藥物濃度、劃線細菌濃度有直接關係。
 
判定標準
 
  一、藥敏實驗的結果,應按抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標準。
  表1 藥物敏感實驗判定標準
抑菌圈直徑(毫米) 敏感度
20以上 極敏
15~20 高敏
10~14 中敏
10以下 低敏
0 不敏
 
  二、藥物敏感實驗判定標準參考表1,多黏菌素抑菌圈;在9毫米以上為高敏,6—9毫米為低敏,無抑菌圈為不敏。
 

 

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