病毒基礎知識（2）

三、病毒學的發展曆程

病毒病害的病原研究階段； 病毒化學和結構研究階段。

（一）病毒病害的病原研究階段
　　自病毒發現直到上個世紀30年代初，病毒學研究主要集中在：分離和鑒定引起各種病毒性疾病的病毒；病毒對疾體所引起的特異性病理效應；病毒的傳播方式和感染宿主範圍；各種理化因子對病毒感染的影響等方麵。
　　在病毒發現的那一年,1898年德國細菌學家勒夫勒和弗施（Loeffler和Frosch）證實了口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)的存在。1911年,勞斯(Rous)發現了引起雞的惡性腫瘤的勞斯肉瘤病毒（Rous sarcoma virus， RSV）。1915-1917年,托特和德愛萊爾（Twort和d′Herelle）分別發現了噬菌體。人們通過過濾性試驗，相繼發現了近百種病毒病害，包括流感、骨髓灰質炎、幾種腦炎、狂犬病、兔的粘液瘤、馬鈴薯花葉病、卷葉病、和條斑病、黃瓜花葉病、小麥花葉病等。而且人們從解決病害觀點出發，在機體水平上研究了病毒感染的症狀、傳播途徑、傳播介體以及病毒的繁殖特征。1899年古巴流行黃熱病，細菌學家裏德（Reed）證明罪犯確實是伊蚊。接著日本人高見（Takami）證明一種葉蟬會傳水稻矮花病，蚜蟲會傳馬鈴薯退化病。300多年前（1619年）就知道的鬱金香碎色病直到1929年才證明是蚜蟲傳的。這時期還發現了一些非常有趣的病毒生物學現象，如一種病毒通過變異，產生致病力強弱不等毒株。而且同一種病毒的不同毒株彼此間有拮抗，稱幹擾現象。還有人發現把病植株的汁液注入到動物體內後，動物的血清和病汁液起特異的反應。這些研究成果都對當時防治病毒病起了重要作用。
　　在這一階段，人們對病毒本質的認識還很膚淺，認為病毒是一種與細菌類似的病原體，所不同的僅在於病毒必須在生活的細胞內才能繁殖，再就是體積十分微小，以致在顯微鏡下不能見到，能夠通過細菌濾器。這也正是在那一時期把病毒稱之為“超顯微的濾過性病毒”的原因。

（二）病毒的化學和結構研究階段
　　1935年，美國生化學家斯坦利（Stanley）發現煙草花葉病毒的侵染性能被胃蛋白酶破壞，在這一現象的啟示下，他幾乎磨了上噸重的感染花葉病的煙葉，企圖用提酶的方法把病毒提純出來。他得到了一小匙在顯微鏡下看來是針狀結晶的東西，把結晶物放在少量水中，水就出現乳光了，用手指沾一點這溶液，在健康煙葉上磨擦幾下，一星期以後這棵煙草也得了同樣類型的花葉病。可見提純的東西的確是有侵染性的煙草花葉病毒。今天在美國加州大學的原來斯坦利實驗室裏，仍然保留著一個標注著“Tob. Mos.”字樣的瓶子，其中就盛著當年第一次提純的煙草花葉病毒（簡稱TMV）。
　　根據各種試驗結果，證明這種結晶物質是蛋白質，初步的滲透壓和擴散測定表明，這種蛋白質的分子量高達幾百萬。其結晶製品的侵染性依賴於蛋白質的完整性，侵染性被認為是病毒蛋白質的一種性質。Stanley 的研究論文1953年發表在Science雜誌上，他在論文中寫道：“煙草花葉病毒是一種具有自我催化能力的蛋白質，它的增殖需要活體細胞的存在”。在獲得TMV結晶之後的將近20年時間裏，許多其他病毒也相繼被結晶出來，1955年，Scaffer和Schwerdt成功地結晶了脊髓灰質炎病毒，它是第一個被結晶出來的動物病毒。然而，Stanley在他的結晶工作中，並未注意到病毒的含磷組分，1936年Bawden和Pirie等在純化的TMV中發現了含磷和糖類的組分，它們以核糖核酸的形式存在，通過熱變化， 這種核酸可以從病毒粒子中釋放出來，這一發現也被Stanley不久證實，Stanley及其同事證實幾種不同植物病毒的核酸也能從核蛋白的形式中被分離出來。
　　TMV的結晶及其化學本質的發現是對醫學和生物科學的巨大貢獻，它不僅引導人們從分子水平去認識生命的本質，而且為分子病毒學和分子生物學的誕生奠定了基礎。鑒於Stanley在TMV研究中的突出貢獻，1946年他被授予諾貝爾獎，這是病毒學領域第一個獲此殊榮的科學家。
    最初從電子顯微鏡照片上看到的病毒是一些幾乎類似的微粒，1939年，G.A.Kansche在電鏡下直接觀察到了TMV，指出TMV是一種直徑為1.5nm，長為300nm的長杆狀的顆粒，而番茄黃化花葉病毒（Tomato yellow mosaic virus, TYMV）顆粒為球形，直徑為25nm。
　　早期電鏡學家獲得的最令人振奮的發現之一是細菌病毒----噬菌體，d′Herelle的噬菌體最初的電鏡照片曾引起很大的轟動。噬菌體雖然非常微小，僅為10nm，但它們具有高度整齊而複雜的結構，它們有圓的頭和起初被認為是尾巴的附屬物，像個小蝌蚪。在爭論多年以後，確定了噬菌體的附屬物沒有運動的功能，但它對噬菌體吸附於細胞表麵和注射傳染性核酸進入到細胞中卻起了重要的作用。
　　病毒學研究的化學時期，還有一些比較重要的進展，1934年M.Schlesinger獲得了純化的噬菌體，1938年W.J.Elford測定了各種病毒顆粒大小等。但總的說來，這一階段，病毒學工作者主要采用敏感動物（如小白鼠）或動物胚胎（如雞胚）來研究病毒，分離鑒定了近百種病毒。同時在機體水平上研究了病毒的繁殖、發病機理和免疫反應等。隻是微生物學的一個分支。同時，對病毒化學本質的了解也較為膚淺，對病毒的概念這一時期，病毒學雖有很大的進展，但尚未形成獨立學科，它還尚有很大爭論，眾說紛紜。

（三）病毒研究的細胞水平時期
　　這一時期，包括本世紀40年代至60年代。在此期間，病毒學不論是在理論上還是在實踐上都有很大的發展，逐步形成了一門獨立的學科。由於這個時期對病毒的化學本質有了更清晰的認識，因而也有了較為統一的、明確的病毒概念。
　　1、利用大腸杆菌研究噬菌體的感染過程取得了迅速發展。以M.Delbruck和A.D.Hershey等領導的“噬菌體小組”圍繞噬菌體與感染細菌細胞的相互關係進行了大量而深入的研究。這一時期的突出貢獻在於：1940年M.Delbruck闡明了噬菌體的複製周期；1950年A.Lwoff揭示了溶原性噬菌體誘導的原理；1952年A.D.Hershey證明了噬菌體DNA的感染性；1952年N.D.Zinder發現了噬菌體的轉導現象；1952年E.Wollman發現了溶原性噬菌體。

　　2、組織培養技術開始應用於動物病毒的研究。我國學者黃禎祥早在1943年就利用雞胚組織塊在試管內進行病毒傳代、定量滴定及中和試驗。我國已故微生物學和病毒學的奠基人高尚蔭院士，1958年在國際病毒學研討會上宣讀了《培養膿細胞的組織培養方法研究》論文，從此揭開了中國昆蟲病毒學研究的新篇章。許多學者采用這一新技術，相繼分離了上百種過去對動物不敏感的新病毒，如腺病毒、副流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、Echo病毒和柯薩奇病毒，大大拓寬了病毒學的研究範圍。組織培養技術不僅發展了臨床病毒學，而且還可用於研究病毒的複製和遺傳，使人們對病毒本質有了進一步的認識。
    1949年J.J.Enders利用單層細胞培養繁殖脊髓灰質炎病毒取得成功，並且由於他對脊髓灰質炎病毒的開創性研究，而於1954年獲得諾貝爾獎。1952年Dulbecco利用細胞單層培養進行了蝕斑試驗，1953年Salk用細胞培養的脊髓灰質炎病毒製備出滅活疫苗，1957年Stewart用細胞培養技術還分離出多瘤病毒。目前組織培養技術已廣泛應用於未知傳染因子的分離，病毒病診斷，疫苗生產，以及病毒感染和複製的基礎研究。
　　組織培養技術對動物病毒研究所作的貢獻主要包括：病毒轉錄新途徑和翻譯新途徑的發現；病毒對宿主範圍的選擇；某些腫瘤病毒引起的細胞轉化；某些病毒侵染引起的細胞融合；發現有的病毒核酸由若幹片段組成；有的病毒核酸具有極性的不同，如小RNA病毒為正鏈RNA病毒，正粘病毒為負鏈RNA病毒。

　　3、植物病毒不斷有重要的發現，如1952年J.I.Harris揭示了TMV外殼蛋白的化學性質，1955年H.Fraenkel-Conrat成功地將TMV的核酸及其蛋白亞基重建出感染的TMV，1956年H.Fraenkel-Conrat還證明TMV-RNA分子具有感染性，1956年F.A.Anderer闡明了TMV外殼蛋白變性的可逆性；1960年A.Tsugita測定了TMV外殼蛋白的氨基酸序列。中國農業大學裘維蕃院士對北京大白菜三大病害和華北小麥叢矮病等進行了深入研究。