伴放線放線杆菌形態變化對菌體表麵疏水性影響的研究

【摘要】  目的 研究伴放線放線杆菌形態變化對菌體表麵疏水性的影響。方法 采用碳氫化合物法檢測伴放線放線杆菌粗糙型和光滑型的菌體表麵疏水性，觀察同一菌株不同表型疏水性的變化。結果 伴放線放線杆菌粗糙型和光滑型菌體表麵具有疏水性。14株粗糙型伴放線放線杆菌菌體表麵疏水率高於4株光滑型， 差異有統計學意義( P<0．05 )。4株同源的粗糙型與其光滑型轉變株比較得出除 1株外，其餘3株菌兩種表型的菌體表麵疏水率差異無統計學意義( P> 0．05 )。結論 伴放線放線杆菌形態變化可引起菌體表麵疏水性的改變 ， 粗糙型轉變為光滑型後菌體表麵疏水性減弱。

【關鍵詞】 伴放線放線杆菌； 疏水性； 形態； 黏附

【中圖號】 R780．2 【文獻標識碼】  A 【文章編號】  1006- 673X( 2008 ) 0l- 0010-03

 

伴放線放線杆菌 ( Actinobacillu actinomycetem-comitans，A．actinomycetemcomitans ) 是牙周可疑致病菌，與侵襲I生牙周炎密切相關。A．actinomycetemcomitans在體外培養過程中可發生粗糙型向光滑型表型的轉變，粗糙型與光滑型體外生長方式不同，粗糙型菌株能夠緊密黏附到各種固體表麵形成生物膜，而光滑型菌株黏附能力明顯下降或喪失。液體培養時粗糙型黏附生長，光滑型浮遊生長。細菌黏附受很多因素影響，疏水性是重要因素之一。細菌疏水性越高，細菌黏附能力越強^［1］ 。我們應用碳氫化合物法檢測A．actinomycetemcomita ns 粗糙型及光滑型菌株表麵疏水性的變化，為進一步了解A．actinomycetemcomitans致病的形態學基礎提供參考。

1．主要儀器及試劑：722光柵分光光度計(上海第三分析儀器廠)。正十六烷( 國藥集團化學試劑有限公司)；PUM緩衝液( K2HPO ·3H₂O 22．2 g，KH ₂PO₄ 7．26 g，尿素1．8 g，Mg S O 4 · 7H₂O 0．2g， 蒸餾水定容1L，pH 7．1)。

2．實驗菌株：伴放線放線杆菌參考菌株ATCC29523、JP2、Y4 (北京口腔醫院研究所提供)；14株伴放線放線杆菌臨床菌株分離自8例不同牙周狀況患者的齦下菌斑；粗糙型菌株均為第2代凍存菌株。   

3．培養：應用伴放線放線杆菌選擇培養基或液體培養基，37℃厭氧培養，固體培養3   d、液體2d。

形態及生化鑒定：粗糙型菌株在選擇培養基上黏附生長，菌落內部呈星形結構，觸酶陽性，乳糖及蔗糖陰性；光滑型菌株除在選擇培養基上生長不黏附及內部星形結構消失外其餘同粗糙型菌株^［2］。

16S rRNA PCR鑒定：上遊引物為5’-AAA CCC ATC TCT GAG TTC TTC TTC-3’；下遊引物為 5’- ATG  CCA  ACT  TGA  CGT  TAA  AT-3’；循環參數為95℃預變性2min，94℃變性30s，55 ℃複性1min，72℃延伸2 min，35個循環，72℃延伸10mi n^［3］。 

白細胞毒素啟動子PCR鑒定：上遊引物為5’-TCC  ATA  TTA  AAT  CTC  CTT   GT-3’， 下遊引物為5’- AAC CTG ATA ACA GTA TT-3’；循環參數94℃預變性7min，94℃變性40s，48℃複性40s，72℃延伸3min, 35個循環，72℃ 終延伸9min^［4］.

5 ．細菌的表型轉變^［2］：複蘇凍存的粗糙型菌株，挑取典型菌落接種TS液體培養基， 37℃厭氧培養，2d傳代1次，至液體培養細菌均勻生長。電鏡下觀察細菌菌毛消失。

6．掃描電鏡標本製備：PBS 200μl製備菌懸液，調致OD₅₆₀= 0．15；取10μl菌懸液滴至3 0 0目銅網，幹燥，2％乙酸鈾酰負染色。  

7． 碳氫化合物法測定疏水性： 各菌固體培養3d收集菌苔。10ml PUM緩衝液洗滌3次，3000r／min離心20rain；以PUM緩衝液為空白對照，用PUM緩衝液調整菌液濃度至660nm波長下OD值為0．5 (OD 660 = 0．5)；取OD660=0．5菌液3mI 加入400  μl十六烷，對照組不加，震蕩 60s，靜置15 min 分層。 取水相；PUM為空白對照，再測量OD₆₆₀值^［5,6］3次，每次平行做4管。

8．疏水率的計算及統計學處理： 疏水率 =(對照組OD ₆₆₀ -實驗組OD ₆₆₀ )×100％／對照組OD ₆₆₀。 采用SPSS11．5統計軟件包，獨立樣本t檢驗比較不同菌株以及同一菌株表型轉變前後疏水性的差異。

 

1．菌株鑒定及菌落形態變化：粗糙型菌株符合其形態及生化特點，PCR檢測與標準菌株一致，掃描電鏡觀察菌體染色深，形態不規則，細胞表麵分布大量不同形態菌毛並可見比較多的附著物，相鄰菌體可借菌毛相連； 光滑型菌株也符合其形態及生化特點，電鏡觀察菌體形態規則，染色比粗糙型淡，菌毛消失，表麵附著物減少。菌株形態通過液體多次傳代，1-2-2，1-2-4，45-1-2,45-2-24株菌從粗糙型轉變為光滑型。

2．疏水性測定：光滑型菌株菌體表麵疏水率低於粗糙型菌株(表1)，差異有統計學意義 ( P< 0．05 )。同一株菌的菌體表麵疏水率粗糙型大於光滑型(表2)，除 1-2-2菌株菌體表麵疏水率差異有統計學意義( P<0．05 )，其他3株菌菌體表麵疏水率差異無統計學意義( P> 0．05)。

表1 伴放線放線杆菌不同菌落形態

菌體表麵疏水率( x±s，％) 

 

表2 伴放線放線杆菌同一株菌不同表型

菌體表麵疏水率( x±s，％) 

 

細菌菌體表麵疏水性的強弱與表麵蛋白、菌毛、脂磷壁酸、莢膜等結構有關^［7,8］證明A．actinomycetemcomitans 從粗糙型轉變為光滑型後菌體這些結構成份存在一定變化。應用聚丙烯酰胺凝膠電泳觀察粗糙型和同源變異光滑型菌株主要外膜蛋白的差異，發現 18、29、45kDa蛋白帶存在於粗糙型菌株，而分子量在31kDa和35kDa左右的2種蛋白與光滑型相關。Haase等^［10］研究發現 RcpA (分子量43kDa )和RcpB(分子量20kDa) 2種蛋白是粗糙型菌株獨有的外膜蛋白。F i n e等^［11］對粗糙型和光滑型菌株的菌體表麵提取物進行免疫印跡分析， 粗糙型菌株CU1000得出分子量為17 kDa和47kDa的2種特有蛋白，2種表型的脂多糖凝膠電泳類型也存在差別。我們通過連續傳代得到4株同源粗糙型轉變為光滑型菌株，電鏡觀察菌毛從存在到消失。

細菌的形態結構與功能是統一的。本研究中A．actinomycetemcomitans菌落從粗糙型轉變為光滑型後黏附能力消失。研究報道粗糙型菌株黏附唾液包被的羥基磷灰石能力強，光滑型黏附能力顯著降低^［11］。細菌的黏附機製很複雜。疏水作用是細菌非特異性黏附機製的重要組成部分，這種表麵特性可能會介導細菌黏附到唾液薄膜上，並與菌斑中其他定植菌發生共聚，從而促進菌斑形成。有關A．actinomycetemcomitans表麵是否存在疏水性的研究報道存在相反的結果。Gibbons 等^［12］用十六烷為底物，采用碳氫化合物法得出A．actinomycetemcomitans 是親水性菌株。而Kozlovsky等用辛烷為底物，碳氫化合物法進行疏水性實驗，得出其疏水率在60％～90％之間。Holm等^［13］用對二甲苯為底物，碳氫化合物法測得新分離 A．actinomycetemcomitans疏水率為71％～85％，而實驗室菌株的疏水率為52％～60％，差異有統計學意義。本實驗采用正十六烷作為檢測底物，用碳氫化合物法檢測伴放線放線杆菌的菌體表麵疏水性，所有實驗菌株菌懸液的終OD值與初始OD值相比有明顯下降，說明部分菌株與正十六烷結合後從水相上升到油層，菌體表麵具有疏水性；粗糙型菌株的疏水率在15％～40％，光滑型菌株的疏水率在12％～33％，與Holm等^［13］糾的研究結果相近。本研究應用菌株包括4株同源粗糙型及光滑型A．actinomycetemcomitans菌株，光滑型疏水率均低於粗糙型菌株。A．actinomycetemcomitans不同菌株之間存在差異。我們在觀察A．actinomycetemcomi tans形態變化中也發現，不同菌株之間在傳代過程中形態轉變的快慢、菌毛的形態及菌毛消失的快慢存在差異。本試驗部分菌株應用同一株菌觀察表型變化前後細菌疏水性的變化可以排除菌株之間的差異。4株菌株中除1株外，其他3株菌的疏水率差異無統計學意義，提示A．actinomycetemcomitans表型變化雖然引起疏水性的一些變化，但與疏水性的實際關係有待擴大菌株量，進一步研究。

細菌的疏水性雖然不同菌種存在差異，但對一定的菌種應在一定範圍之內。伴放線放線杆菌疏水性檢測不同實驗結果差異比較大可能與實驗中所用的菌株、疏水性底物、細菌生長條件等不同有關。Kozlovsky等比較不同培養基、培養時間對疏水性的影響，菌體表麵疏水率固體培養低於液體培養， 培養時間延長疏水率降低；另外我們在實驗中也發現伴放線放線杆菌光滑型在液體中分散均勻，粗糙型菌株能夠產生自凝、沉澱，細菌的分散及分散後的穩定性受到一定影響，也會影響OD值的結果及最後疏水率的記算。

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