不同培養基對腸毒素大腸杆菌載體疫苗株免疫原性的影響

 

     摘要：分別采用固體CFA培養基和液體LB培養基培養，全菌ELISA，口服免疫Balb／c抗體測定，評價腸毒素大腸杆菌抗原CFA／I，CS6和載體誌賀氏痢疾杆菌LtX5的免疫原性．結果表明：LB培養基培養不影響疫苗株抗原免疫原性．由此提示，LB培養基對腸毒素大腸杆菌載體疫苗生產是行之有效的．

    關鍵詞：腸毒素大腸杆菌；載體疫苗；培養基；免疫

 

腸毒素大腸杆菌(Enterotoxigenic  Escherichia  coli， ETEC) 是引起旅遊者和發展中國家嬰幼兒腹瀉的主要致病菌^［1］．目前，疫苗的研製主要是針對定居因子菌毛和腸毒素而進行的，包括滅活菌苗^［2］、亞單位疫苗^［3］ 、和載體疫苗^［4..5］等．

由於疫苗隻有在CFA固體培養基上培養，ETEC菌毛才能有效地表達，因此，ETEC滅活苗的研製都是采用CFA固體培養基培養進行生產的．筆者采用基因重組的手段，構建了以痢疾疫苗株為宿主的E T E C 載體疫苗．由於擔心液體培養可能會造成ETEC菌毛的嚴重脫落，所以一直采用固體培養．與固體培養相比，液體培養更為經濟、方便，產生汙染的機率更低， 更適於生產需求．因此，筆者曾嚐試以3種液體培養基，即CFA( 不添加瓊脂)，TS(T rypticase Soy broth)，LB(Luria  Berteani  broth)培養ETEC疫苗，結果發現菌毛抗原能夠在3種培養基中表達，且以LB培養基培養的效果最顯著，而非CFA^［6］．本研究將進一步比較固體CFA與液體LB之間的差別，評價液體培養與固體培養2種模式對疫苗的菌毛表達及免疫原性的影響水平，從而為ETEC疫苗的生產，尋找疫苗生長和抗原表達的合適培養基提供依據． 

1． 1． 1  茵株  產生ETEC CFA／I，CS6菌毛抗原的疫苗候選株FWL01 (pZCF16)，誌賀氏痢疾杆菌福氏2a疫苗T32的天冬氨酸一B一半醛脫氫酶(aspartateβ-semiaidehyde dehydro genase asd) 基因突變株FWL01^［7］．表達CFA／I野生ETEC菌E．coli44813，表達CS6野生 E T E C菌E  c o l i   5 1 9 ／ 6 6 A． 野生菌均購自 

中國藥品生物製品鑒定所．

1．1．2 培養基  CFA培養基(水解酪蛋白10g·L^-1 酵母粉115 g·L^-1，MgSO₄·7H₂ O 0．0 5 g·L ^-1，MnCI ₂ 0．005 g·L^-1，調pH至 7．4 )，普通液體LB培養基．

1．1．3 抗體  抗CFA／I單克隆抗體由瑞典Gobebourgs大學Svennerhom教授惠贈，CS6， LPS多克隆抗體

I．1．4 實驗動物  6～8周齡雌性Balb／c小鼠，由軍事醫學科學院動物中心提供，在 S P F動物房飼養

 

1．2．1 細菌培養  LB培養基培養：將菌株過夜培養物，按1％的接種量接種於新LB液體培養基中，震蕩培養16 h．CFA培養基培養：同樣取菌株過夜培養物，以1 m L塗勻羅氏瓶， 倒置培養16 h． 培養溫度均為37℃．

1．2．2 全菌ELISA   按照文獻[8]進行．

1．2．3 動物免疫與抗體測定  按照文獻[5]進行．

1．2．4 統計學方法  統計每組樣品的ELISA結果，進行t檢驗分析^［9］．   

 

2．1   不同培養條件對疫苗候選株抗原表達水平的影響 疫苗候選株FWL01(pZCF16)是采用生物T程手段，分別將ETEC的2種重要的保護性抗原CFA／I和CS6基因克隆到載體疫苗株福氏2a  T32中，通過asd基因的宿主一質粒平衡致死係統來保持質粒，並穩定表達ETEC抗原．同野生ETEC相比，在此疫苗中，ETEC抗原不再受原ETEC表達係統的調控， 而是依賴外源啟動子的作用進行組成性表達．將收獲的培養物用PB調A 枷值為1，包被酶聯板，進行全菌ELISA．2種培養方法的統計結果表明，P>0．05．說明采用LB液體培養， 疫苗候選株生長和抗原表達良好，CFA／I，CS6及宿主LPS (1ipopolysaccharide)菌達到了與 CFA培養基培養相一致的結果(見表1)．

 

 

2．2 不同培養條件對血清抗體IgG的影響  對2種不同方法新鮮培養的候選疫苗株，以相同菌量( 2 x 10⁸ ) 口服免疫各Balb／c小鼠組(每組5隻)，2周免疫1次，共免疫3次，每次免疫前進行眼底采血和新鮮糞便收集， 製備抗血清和糞便sI— g A，最後 1次免疫2周後采血．除CF A／I抗體IgG外，經2種不同培養條件培養，ETEC抗原CS6和宿主菌抗原LIPS 2種特異性抗體IgG滴度完全一致．t檢驗結果P> 0．05，說明對候選疫苗株各抗原的免疫原性沒有顯著影響．

2．3   不同培養條件對糞便黏膜抗體slgA的影響  對製備糞便抗體進行50倍稀釋，測定糞便抗CFA／I和CS6的sIgA抗體含量．數據顯示 (圖2)，LB液體培養疫苗候選株同CFA固體培養相比，激發機體產生的黏膜抗體sIgA含量稍低． 但 t  檢驗分析兩培養組產生的 s I g A抗體，P>0．05，此結果說明，2種培養方法對候選疫苗株各抗原激發機體內的黏膜抗原抗體反應同樣有效．

最後一次采血後，處死Balb／c小鼠，取3 c m 小腸， 剪碎後加400μL 含0．05 mol· L^-1   EDTA的0．01 mol·L PBS懸浮，離心，收集上清液，製備腸液抗體slgA．對製備抗體進行50倍稀釋，測定抗CFA／I和CS6的slgA抗體．數據顯示 (表2)，CFA／I，CS6，經LB液體培養製備的免疫菌在Balb／csb鼠體內產生了較低的抗體低度．t檢驗結果為P >0．05，表明LB液體培養不影響ETEC抗原CFA／I和CS6的黏膜抗原抗體反應．

 

Samples were diluted at 1:50

 

ETEC流行病學研究結果表明：ETEC定居因子，即為菌體表麵菌毛，與小腸黏膜黏附和腸毒素致毒是ETEC腹瀉不可或缺的2個必要條件．ETEC疫苗研究結果顯示：兩者同時又是激發機體產生有效免疫保護的主要抗原，是研製 E T E C疫苗最重要的2種組分．對於野生ETEC，ETEC菌毛的表達，需要Mg²⁺，Mn²⁺ 等離子，而且極易脫落．因此，為獲得ETEC菌毛的充分表達，傳統上一直沿用CFA固體培養基培養．不過，與固體培養相比， 液體培養一直是菌體培養的首選．

載體活菌疫苗是當前 E T E C疫苗研究中最為活躍的類型之一． 特點是免疫接種後， 重組菌能夠在機體內繁殖， 產生保護性抗原， 並以載體菌為佐劑，持續激發機體產生特異性免疫性反應．對本研究構建的疫苗候選株FWL01(pZCF16)，ETEC抗原CFA／I和CS6表達不受原ETEC的調控限製．通過比較傳統固CFA和液體LB 2種培養基對疫苗候選株抗原表達與免疫原性的影響發現，常規LB培養基無論是菌毛表達和免疫Balb／c小鼠後產生的Ig G和黏膜sIgA抗體方麵，都獲得了基本一致的實驗效果．同時，對載體菌抗原LPS的表達與免疫原性評價結果顯示，外源抗原表達不影響載體菌自身抗原的表達與免疫原性， 2種培養方法對載體菌自身的生長和在機體中的免疫作用同樣有效． 該結果為本研究和開發ETEC載體疫苗的大規模生產提供了依據．   

作者：鄭繼平^1a， 郭桂英 ^1b，韋雙雙^1a，周海龍^1a，張兆山 ²

作者單位：1．海南大學a．生命科學與農學院，b．教務處，

2．軍事醫學科學院 生物工程研究所，《海 南 大 學 學 報 自 然 科 學 版 》