MPN法測定硝化細菌數量

硝化作用是指氨經過微生物的作用氧化成亞硝酸和硝酸的過程。它是由兩類細菌分兩個階段完成的。第一階段是氨氧化為亞硝酸，由亞硝化菌完成；第二階段是由亞硝酸氧化為硝酸，由硝化菌完成。所以測定時需要測定亞硝酸菌和硝酸菌數量

 

實驗樣品來自實驗一不同高度取出的濾料，測砂子上硝化細菌：取1g砂子在無菌水中振蕩多長時間？

改良的斯蒂芬遜（Stephenson）培養基A、B

 

(NH₄)₂SO₄        2.0g             

NaH₂PO₄         0.25g

MnSO₄·4H₂O      0.01g

MgSO₄·7H₂O      0.03g

K₂HPO₄          0.75g

CaCO₃           5.0g

蒸餾水           1000ml

PH               7.2

 

NaH₂PO₄         0.25g

K₂HPO₄          0.75g

MgSO₄·4H₂O      0.03g

MnSO₄           0.01g

CaCO₃            1.0g

Na₂CO₃           1.0g

NaNO₃                 1.0g

蒸餾水            1000ml

PH                7.2

 

 

121℃滅菌         30min

 

無菌吸管、試管（1.8cm×18cm）、白瓷比色板、接種環、酒精燈等。

 

格裏斯試劑（Griess Reagent）第一、第二液：

第一液：將0.5g的對氨基苯磺酸（Sulfanilic Acid）加到150ml的20%稀醋酸溶液中。

第二液：將1gα-萘胺（α-naphthylamine）加到20ml蒸餾水和150ml的20%稀醋酸溶液中。

 

二苯胺試劑：溶0.5g無色的二苯胺（Diphenylamine）於20ml蒸餾水及100ml濃硫酸（相對密度1.84）中即成。

 

1.2實驗方法：

1.2.1亞硝酸菌測定：將培養基A分裝於試管中，每管5ml，每個樣品需培養基19支試管。砂粒懸液采取10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7六個稀釋度。在每個培養基中，用無菌吸管接種砂粒懸液1ml。每個稀釋度重複3管，另取一管培養基接種1ml無菌水作為對照。於25～28℃培養。10～14d後，取出培養液5滴於白瓷比色板上，加入格裏斯試劑（Griess Reagent）第一、第二液各兩滴，如有亞硝酸鹽存在，則呈紅色。從《三次重複數量指標》表中求的數量指標後，換算成每克幹砂粒的亞硝化細菌數量。

 

1.2.2硝酸菌測定：將培養基B分裝於試管中，每管5ml，每個樣品需培養基16支試管。砂粒懸液采取10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、五個稀釋度。在每個培養基中，用無菌吸管接種砂粒懸液1ml。每個稀釋度重複3管，另取一管培養基接種1ml無菌水作為對照。於25～28℃培養。10～14d後測定硝酸的產生，取出培養液5滴於白瓷比色板上，加入格裏斯試劑（Griess Reagent）第一、第二液各兩滴，如不呈紅色，表示亞硝酸均已經完全消失。此時，另取培養液5滴於白瓷比色板上，加二苯胺試劑2滴，如呈藍色，則表示亞硝酸已經被氧化成硝酸，說明有硝酸細菌的存在。從《三次重複數量指標》表中求的數量指標後，換算成每克幹砂粒的亞硝化細菌數量。

 

1.2.3《三次重複數量指標》（略）