微生物常規鑒定技術

微生物常規鑒定技術

一、形態結構和培養特性觀察

1、微生物的形態結構觀察

微生物的形態結構觀察主要是通過染色，在顯微鏡下對其形狀、大小、排列方式、細胞結構(包括細胞壁、細胞膜、細胞核、鞭毛、芽孢等)及染色特性進行觀察，直觀地了解細菌在形態結構上特性，根據不同微生物在形態結構上的不同達到區別、鑒定微生物的目的。

2、微生物培養特性觀察

革蘭染色法，丹麥病理學家C.Gram 1884年創立(1)塗片 (2)晾幹 (3)固定 (4)結晶紫色染色：1min。水洗 (5)媒染：滴加盧哥氏碘液，媒染1min。水洗(6) 脫色：將玻片傾斜，連續滴加95%乙醇脫色20～25s至流出液無色，立即水洗。　(7) 複染：滴加蕃紅複染5min。水洗(8) 晾幹：晾幹或者用吸水紙吸幹。　(9) 鏡檢：先用低倍，再用高倍，最後用油鏡。　(10)實驗完畢後的處理：①浸過油的鏡頭：a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。b.用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭擦2～3次。c.再用幹淨的擦鏡紙將鏡頭擦2～3次。注意擦鏡頭時向一個方向擦拭。②細菌染色玻片用廢擦鏡紙將香柏油擦幹。

微生物培養特性的觀察是微生物檢驗鑒別中的一項重要內容。

1)細菌的培養特征    包括以下內容：在固體培養基上，觀察菌落大小、形態、顏色(色素是水溶性還是脂溶性)、光澤度、透明度、質地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性等。在液體培養中的表麵生長情況(菌膜、環)混濁度及沉澱等。半固體培養基穿刺接種觀察運動、擴散情況。

2)黴菌酵母菌的培養特征：大多數酵母菌沒有絲狀體，在固體培養基上形成的菌落和細菌的很相似，隻是比細菌菌落大且厚。液體培養也和細菌相似，有均勻生長、沉澱或在液麵形成菌膜。

黴菌有分支的絲狀體，菌絲粗長，在條件適宜的培養基裏，菌絲無限伸長沿培養基表麵蔓延。黴菌的基內菌絲、氣生菌絲和孢子絲都常帶有不同顏色，因而菌落邊緣和中心，正麵和背麵顏色常常不同，如青黴菌：孢子青綠色，氣生菌絲無色，基內菌絲褐色。黴菌在固體培養表麵形成絮狀、絨毛狀和蜘蛛網狀菌落。

二、生理生化試驗

微生物生化反應：指用化學反應來測定微生物的代謝產物，生化反應常用來鑒別一些在形態和其它方麵不易區別的微生物。因此微生物生化反應是微生物分類鑒定中的重要依據之一。

微生物檢驗中常用的生化反應有：

糖或醇類發酵試驗       澱粉水解試驗       V-P試驗       甲基紅(MR)試驗          靛基質(Indole)試驗    

過氧化氫酶試驗        硝酸鹽還原試驗     明膠液化試驗   尿素酶(Urease)試驗         氧化酶試驗              

硫化氫(H2S)試驗   三糖鐵(TSI)瓊脂試驗    氨基酸脫羧酶的測定    耐鹽性試驗      卵磷脂酶的測定

石蕊牛奶反應           酪蛋白水解      苯丙氨酸脫氨試驗       氰化鉀試驗            對疊氮化鈉的抗性　　　　　

硫化氫-靛基質-動力(SIM)瓊脂試驗        含碳化合物的利用(檸檬酸鹽或丙酸鹽利用)

三、血清學試驗

血清學反應是指：相應的抗原與抗體在體外一定條件下作用，可出現肉眼可見的沉澱、凝集現象。在食品微生物檢驗中，常用血清學反應來鑒定分離到的細菌，以最終確認檢測結果。

在細菌的檢測中，應用最多的是凝集試驗、沉澱反應和補體結合試驗。

血清學試驗的一般特點：

1)抗原體的結合具有特異性，當有共同抗原體存在時，會出現交叉反應。

2)抗原體的結合是分子表麵的結合，這種結合雖相當穩定，但是可逆的。

3)抗原體的結合是按一定比例進行的，隻有比例適當時，才能出現可見反應。

4)血清學反應大體分為兩個階段進行，但其間無嚴格界限。第一階段為抗原體特異性結合階段，反應速度很快，隻需幾秒至幾分鍾反應即可完畢，但不出現肉眼可見現象。第二階段為抗原體反應的可見階段，表現為凝集、沉澱、補體結合反應等。反應速度慢，需幾分、幾十分以至更長時間。而且，在第二階段反應中，電解質、PH、溫度等環境因素的變化，都直接影響血清學反應的結果。

1、凝集反應(Agglutination reaction)

顆粒性抗原(細菌、紅細胞等)與相應抗體結合，在電解質參與下所形成的肉眼可見的凝集現象，稱為凝集反應。其中的抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。在該反應中，因為單位體積抗體量大，做定量實驗時，應稀釋抗體。

1)直接凝集反應：a. 玻片凝集法； b. 試管凝集法       2)間接凝集反應

2、沉澱反應(Precipitation test)

可溶性抗原與相應抗體結合，在有適量電解質存在下，經過一定時間，形成肉眼可見的沉澱物，稱為沉澱反應。反應中的抗原稱為沉澱原，抗體為沉澱素。由於在單位體積內抗原量大，為了不使抗原過剩，故應稀釋抗原，並以抗原的稀釋度作為沉澱反應的效價。

1)環狀沉澱反應 2)絮狀沉澱反應3)瓊脂擴散試驗

3、補體結合反應(Complement fixation reaction)

補體結合反應是在補體參與下，以綿羊紅細胞和溶血素作為指示係統的抗原抗體反應。補體無特異性，能與任何一組抗原抗體複合物結合而引起反應。如果補體與綿羊紅細胞、溶血素的複合物結合，就會出現溶血現象; 如果與細菌及相應抗體複合物結合，就會出現溶菌現象。因此，如果出現溶菌，說明抗原抗體是相對應的(試驗結果陽性)；如果出現溶血，說明抗原抗體不相對應(陰性)。

此反應操作複雜，敏感性高，特異性強，能測出少量抗原和抗體，所以應用範圍較廣。

其它方法：熒光抗體技術,   ELISA,   免疫組化