致病性(致瀉性)大腸埃希氏菌及其檢驗（下）

二、中毒機製與主要症狀

1. 中毒機理     腸道內感染的機製如下：

1)腸毒素型大腸杆菌(ETEC)：主要引起腹瀉(幼畜或雛雞)，約有40個血清型。腸毒素型菌株進入腸道後主要在小腸內繁殖，不損害腸上皮細胞。繁殖過程中產生腸毒素。

2)腸致病型大腸杆菌(EPEC)：是引起嬰兒腹瀉的主要病原菌，該菌不產腸毒素，也無侵襲力，致病機理不清，約有18個血清型。

3)腸侵襲型大腸杆菌(EIEC)：較少見，該菌不產腸毒素，但侵襲大腸腸壁上皮細胞，引起炎症反應，形成潰瘍，約有8個血清型。引起類似痢疾的症狀。

2. 主要症狀：a.腸道內感染主要造成腹瀉與痢疾樣疾病；腸道外感染主要引起尿路感染，新生兒腦膜炎，敗血症及其他部位的感染。b.大腸杆菌引起的食物中毒是感染型和毒素型的綜合作用。主要症狀為急性腸胃炎，潛伏期為12～24h，臨床出現嘔吐、腹瀉、發熱(一般不超過39℃)、頭痛、腹痛等，病程一般為1～3d。

三、檢驗

•        檢驗方法  包括增菌、細菌分離、生化試驗、大腸杆菌致病性鑒定(血清學試驗、毒素檢測等)。

•        致病性大腸杆菌的檢驗程序 見GB/T 4789.6-2003)

1. 增菌2. 細菌分離 3. 生化試驗4. 血清學試驗 5. 毒素檢測6. 結果判定與報告

增菌培養   1、以無菌操作稱取樣品25g，加入225mL營養肉湯培養基中，可用滅菌砂在研缽中磨碎或以均質器打碎樣品。2、取適量接種於乳糖膽鹽培養基中，測定大腸菌群MPN；其餘移入500ml三角瓶中於36±1℃培養6h。挑取一環，接種於一管30mL腸道菌增菌肉湯中，42℃增菌培養18h。

分離培養   1、將發酵乳糖陽性管液和增菌液分別劃線接種於麥康凱或伊紅美蘭瓊脂平板上2、於36±1℃培養18～24h觀察菌落   對於汙染嚴重的食品可直接按劃線法接種，不經過增菌過程。

生化試驗在鑒別平板上挑取菌落5個以上，分別接種於TSI瓊脂(或克氏雙糖鐵)，以及pH7.2尿素、蛋白腖水、半固體、 KCN肉湯和賴氨酸脫羧酶培養基中。經36 ℃ 培養18～24h。TSI斜麵產酸或不產酸，底層產酸，H2S陰性、KCN陰性和尿素酶陰性的培養物為大腸埃希氏菌。 TSI底層不產酸，或H2S、KCN和尿素酶任何一項陽性的為非大腸埃希氏菌。必要時做氧化酶試驗和革蘭氏染色。

血清學試驗    假定試驗：從平板上挑取經生化試驗證實為大腸埃希氏菌的培養物，用EPEC、EIEC、ETEC三種多價O血清和EHEC　O157診斷血清做玻片凝集試驗。不凝集的培養物可做陰性報告。當與某一多價O血清凝集時，再用該多價血清包括的單價O血清分別做試驗，出現凝集即為假定試驗陽性。

證實試驗：單管凝集試驗  (O抗原＋1﹕400血清)

腸毒素試驗    ELISA檢測LT和ST：①LT檢測方法(雙抗體夾心法) ②ST檢測方法(抗原競爭法)。雙向瓊脂擴散試驗檢測LT；乳鼠灌胃試驗檢測ST。

雙向瓊脂擴散試驗：將被檢菌按5點環形接種於Elek氏培養基上，以同樣操作共做兩份，36±1℃培養48h，在每株菌的菌苔上各放一片多粘菌素紙片，36+1℃經5～6h，使抗生素滲入瓊脂中，在五點環形菌苔各5mm處的中央，挖一個直徑4mm的園並用一滴瓊脂墊底。在一份平板的孔內滴加LT抗毒素30ul，另一份平板的孔內滴加ST毒素30ul。放於36+1℃經15～20h觀察結果，在菌斑和抗毒素之間出現白色沉澱帶為陽性，無沉澱帶者為陰性。

乳鼠灌胃試驗：每1mL檢樣濾液加入2%依文思蘭溶液0.02mL作為標記。選擇1～4日齡的乳鼠，用裝有塑料小管的注射器將0.1mL檢樣注入乳鼠胃內，每組注射3～4隻。禁食3～4h後用氯仿處死，拉出全部腸管並稱重(包括積液)，與剩餘體重比較。若腸管重量與剩餘體重之比大於0.09，判為陽性；比值為0.07～0.09，可疑。本法主要用於測定ST。