結核分支杆菌檢驗

 結核分支杆菌檢驗
 Mycobacterium tuberculosis

 

一、結核分支杆菌與結核病

n結核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)俗稱結核杆菌，屬於分枝杆菌屬(Mycobacterium)，可引起人和牛(主要是奶牛)、豬、禽類的結核病。該菌屬是一類細長略彎曲的微生物，有時有分枝或出現絲狀體。目前在分類學上已將分枝杆菌屬歸納於放線菌中。主要有人型、牛型、禽型、鼠型和冷血動物型及非洲型。已知人型、牛型和非洲型對人有致病性。禽型可能也對人致病。

n牛，特別是奶牛對結核杆菌最易感。牛常見的結核病是肺、乳房、淋巴結結核，有時可見腸、生殖器、漿膜結核及全身性結核。豬主要表現為淋巴結核，最常患病的部位是頜下、咽、頸及腸係膜淋巴結。禽類主要對禽型結核杆菌敏感，主要侵害肝、脾等。

n人的結核以肺結核最為常見，此外有淋巴結核、腸結核、骨結核等。據WHO報道，每年約有800萬新病例發生，至少有300萬人死於該病。人感染結核病，除通過呼吸道途徑外，還可通過動物性食品尤其是汙染的牛乳經消化道而感染，病畜肉對人也有一定威脅。因此，牛乳或肉食品中的結核杆菌汙染以及奶牛等畜禽的結核病在食品衛生方麵具有重要意義，是預防人類結核病的重要環節。

nIn 1882, a few years after he discovered the bacillus responsible for anthrax, German physician Robert Koch (1843-1910) published his studies revealing the organism behind TB, Mycobacterium tuberculosis.  Suddenly, contaminated raw  milk, and it's role in infant ,mortality, became a lot  clearer.

 

二、生物學特性

(一)形態與染色特性

n結核分枝杆菌為細長略帶彎曲、兩端鈍圓的杆菌，長1～4μm，寬0.2～0.5μm。牛分枝杆菌則比較粗短。無芽孢，無動力。在陳舊培養物或幹酪化的淋巴結中可看到分枝狀。分枝杆菌屬的細菌細胞壁脂質含量較高，約占幹重的60%，特別是有大量分枝菌酸(mycolic acid)包圍在肽聚糖層的外麵，可影響染料的穿入，若經加溫或延長染色時間而著色後能抵抗強脫色劑鹽酸乙醇的脫色，故又稱抗酸杆菌(acid-fast bacilli)。分枝杆菌一般用齊尼(Ziehl-Neelsen)抗酸染色法，以5% 石炭酸複紅加溫染色後可以染上，但用3%鹽酸乙醇不易脫色。若再加用美藍複染，則分枝杆菌呈紅色，而其他細菌和背景中的物質為藍色。

n近年發現結核分枝杆菌在細胞壁外尚有一層莢膜。一般因製片時遭受破壞而不易看到。若在製備電鏡標本固定前用明膠處理，可防止莢膜脫水收縮。在電鏡下可看到菌體外有一層較厚的透明區，即莢膜，莢膜對結核分枝杆菌有一定的保護作用。

(二)培養特性

n結核分支杆菌專性需氧。最適溫度為37℃，低於30℃不生長。對營養要求較高，必須在含有血清或卵黃、某些無機鹽和碳源(葡萄糖、甘油及丙酮酸鈉)的特殊培養基上才能生長。即使在最適條件下生長仍很緩慢，需10～20d才能在固體培養基上出現可見菌落。常用的有羅氏(Lowenstein-Jensen)固體培養基，內含蛋黃、甘油、馬鈴薯、無機鹽和孔雀綠等。孔雀綠可抑製雜菌生長，便於分離和長期培養。蛋黃含脂質生長因子，能刺激生長。菌落為淺黃色，小而幹燥，不透明，表麵粗糙、皺縮，形似菜花心。在液體培養基中一般1～2周即可生長，可形成菌膜，加入吐溫-80(Tween-80)等表麵活性劑，則可提高細菌生長率，並使其均勻生長。

(三)生化特性

各型結核杆菌均不發酵糖類，人型和牛型菌株能產生尿素酶。人型菌株還可還原硝酸鹽，能產生煙酸。結核分枝杆菌大多數觸酶試驗陽性，而熱觸酶試驗陰性。人結核分支杆菌和牛分支杆菌、鳥分支杆菌的特性比較見表6-3-1。

(四)抵抗力

n本菌對幹燥的抵抗力特別強。粘附在塵埃上保持傳染性8～10d，在幹燥痰液中可存活6～8個月。結核分支杆菌細胞壁中含有脂質，故對乙醇敏感，在70%乙醇中2min死亡。結核杆菌對紫外線敏感，直接日光照射數小時可被殺死，可用於結核患者衣服、書籍等的消毒。對常用消毒劑如石炭酸有較強的抵抗力。在4%NaOH(W/V)、3%HCl(W/V)或6%硫酸(W/V)中30min活力不受影響(因此可用此法進行有雜菌汙染檢樣的預處理)。對濕熱敏感，經60℃、30min或80℃、5min死亡，巴氏消毒法可有效殺死本菌。結核杆菌對1﹕13 000孔雀綠有抵抗力，加在培養基中可抑製雜菌生長。

 

三、檢驗

一)結核杆菌的常規檢驗      包括顯微鏡檢查、細菌培養、動物試驗、結核菌素試驗等。

1. 顯微鏡檢查

n用檢樣製塗片，進行齊-尼氏抗酸染色和革蘭氏染色，鏡檢。若被檢材料是痰液或病灶，則檢出革蘭氏陽性的抗酸菌即可初步判斷；而在牛乳、糞便、尿液中檢出抗酸菌，必須再進一步鑒定。

    2. 細菌檢查

n(1)濃縮集菌：先集菌後檢查，可提高檢出率。腦脊液和胸、腹水無雜菌，可直接離心沉澱集菌。痰、支氣管灌洗液、尿、糞等汙染標本需經4% NaOH(痰和堿的比例為1:4,尿、支氣管灌洗液和堿的比例為1:1)處理15min。尿標本先加5% 鞣酸、5% 乙酸各0.5ml於錐形量筒內靜置，取沉澱物處理。處理後的材料再離心沉澱。取沉澱物作塗片染色鏡檢。若需進一步作培養或動物接種，應先用酸中和後再離心沉澱。

n(2)固體培養法：取檢樣接種於固體培養基，分別置暗處和有光處，37℃培養4～8周後觀察。根據生長快慢、菌落特性、色素產生情況及抗酸性強弱做出判斷。如培養特性不典型，則須進一步鑒定。

n(3)玻片培養法：檢樣經濃縮集菌後，塗布於滅菌小玻片上(不固定)，置於有血液或血清的液體培養基中，37℃培養5～7d，取出染色檢查。

    3. 動物試驗    分離細菌、測定毒力及分型時均可應用。常用豚鼠或地鼠。將檢樣注射於腹股溝皮下，3～4周後如發現局部淋巴結腫大或結核菌素試驗陽性，即可剖檢，觀察淋巴結、肺、肝等髒器有無病變，並進行塗片染色鏡檢及細菌培養。動物接種的陽性率較染色鏡檢和細菌培養高，但耐異煙肼菌株毒力明顯減弱，會影響實驗結果。若6～8周仍不見發病，也應進行解剖檢查。

4. 結核菌素試驗   

作為診斷結核病的方法，在人隻適於嬰幼兒；在動物檢疫中多應用於牛，雞和其它動物必要時也可應用。

結核菌素試驗是牛結核病檢疫時的主要方法，有皮內法、點眼法和皮下法3種。最好將前兩種方法同時並用，即用舊結核菌素(old tuberculin，OT)或純蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)同時進行皮內注射和點眼。根據注射部位的熱痛、腫脹等炎症反應，以及眼結膜反應、眼瞼腫脹狀態和眼分泌物的質與量進行判斷。皮內接種和點眼任一方法呈陽性，即為結核菌素試驗陽性。

    禽類檢疫時，用禽型結核菌素0.1mL注射於雞的肉垂內，以48h出現腫脹和發紅為陽性。

二)其它檢驗方法

    1. 熒光染色法    將檢樣塗片固定，然後用0.1%金胺石炭酸溶液染色，再用3%鹽酸酒精脫色，最後以美蘭飽和酒精溶液複染，於熒光顯微鏡下檢查。若視野中有黃綠色明亮熒光的杆菌，即可作初步判斷。該法比常規抗酸染色法檢出率高。

2. 生化試驗    生化試驗是鑒定結核杆菌的快速方法。主要包括煙酸試驗、硝酸鹽還原試驗、過氧化氫酶試驗、尿素酶試驗及β-葡萄糖苷酶試驗等。

3. 血清學試驗    血清學方法如間接血凝試驗、ELISA、放射免疫測定、免疫熒光等，其中ELISA是目前檢測結核病抗體的最好方法，對人的活動性結核檢出率為55%～90%，對動物結核的檢出率為50%～60%。

4. PCR快速診斷　　一般塗片檢查菌數需5´103～5´104/mL，培養需1´102/mL，少於此數時不易獲得陽性結果，且培養需時較長。目前已將多聚酶鏈反應(PCR)擴增技術應用於結核分枝杆菌DNA鑒定，每毫升中隻需含幾個細菌即可獲得陽性結果，且1～2d得出結果。