纖維素是地球上含量最豐富的多糖類物質，它能被土壤中某些微生物分解利用，是因為它們能夠產生纖維素酶。本實驗通過從土壤中分離分解纖維素的微生物，初步鑒定了其形態特征和生理生化特性，為日後更進一步的研究打下基礎。
一:實驗原理
1.纖維素與纖維素酶
纖維素與澱粉都是由葡萄糖組成的，但組成兩者的葡萄糖的連接方式不同，因而使兩者的形態完全不同。纖維素是由葡萄糖分子按β-1,4糖苷鍵連接而成的，澱粉是由葡萄糖分子按α-1,4糖苷鍵連接而成的。
人類以澱粉為主要能量來源，但完全不能消化纖維素，而反芻動物和大量的微生物則主要以纖維素為能量來源。這是因為，在反芻動物的瘤胃中生活著大量的可以分解纖維素的微生物。微生物產生的纖維素酶是一種複合酶，包括內切酶（Cx酶）、外切酶（C1酶）和葡萄糖苷酶。內切酶作用於無定型的纖維素區域，使纖維素斷裂成片段；外切酶又叫纖維二糖水解酶，它可以作用於纖維素的結晶區或小片段纖維素，從糖鏈末端開始切掉兩個葡萄糖分子，產生纖維二糖；葡萄糖苷酶則將纖維二糖分解成葡萄糖。
2.兩種剛果紅染色法的比較
剛果紅在篩選纖維素分解菌上的應用已經有超過20年的曆史，在本課題中我們給出了兩種方法。方法一是傳統的方法，缺點是操作繁瑣，加入剛果紅溶液會使菌落之間發生混雜；其優點是這樣顯示出的顏色反應基本上是纖維素分解菌的作用。方法二的優點是操作簡便，不存在菌落混雜問題，缺點是由於纖維素和瓊脂、土豆汁中都含有澱粉類物質，可以使能夠產生澱粉酶的微生物出現假陽性反應。但這種隻產生澱粉酶的微生物產生的透明圈較為模糊，因為培養基中纖維素占主要地位，因此可以與纖維素酶產生的透明圈相區分。方法二的另一缺點是：有些微生物具有降解色素的能力，它們在長時間培養過程中會降解剛果紅形成明顯的透明圈，與纖維素分解菌不易區分。
二．實驗流程
1．土樣的采集
土壤中的微生物，大約70%~90%是細菌。細菌適宜在酸堿度接近中性的潮濕土壤中生長，絕大多數分布在距地表約3~8cm的土壤層。因此，土壤取樣時，一般要鏟去表層土。另外，土樣的采集要選擇富含纖維素的環境，這是因為在纖維素含量豐富的環境，通常會聚集較多的分解纖維素的微生物。綜合各種因素，本小組從圖書館後院的落葉堆積叢取土樣。
2．選擇培養_富集培養
在將樣品稀釋塗布到鑒別纖維素分解菌的培養基之前，先通過選擇培養增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離到所需要的微生物。
富集培養所需要的儀器有：250ml錐形瓶、天平、藥匙、玻璃棒、電爐、搖床、玻璃珠、稱量紙等。
選擇培養基的製備比例見下：
纖維素分解菌的選擇培養基
纖維素粉 5g
NaNO3 1g
Na2HPO4•7H2O 0.5g
KH2PO4 0.9g
MgSO4•7H2O 0.5g
KCl 0.5g
酵母膏 0.5g
水解酪素 0.5g
將上述物質溶解後,用蒸餾水定容到1000ml
按上表比例配製50ml選擇培養基。在250ml錐形瓶中裝入50ml培養基，放5~6顆玻璃珠，用8層紗布做成瓶塞，將瓶口塞緊，再在瓶塞外包裹兩層牛皮紙，用線繩紮緊，在121℃下高壓蒸汽滅菌20min。
稱取土樣20g，在無菌條件下加入裝有50ml培養基的錐形瓶中。將瓶置於搖床上，在30℃下振蕩培養3~4d，至培養基變渾濁。
3.梯度稀釋
用量程為1000µL的移液管從富集培養土壤液中吸取1ml土壤懸液加入盛有9ml無菌水的試管中充分混勻。然後從此試管中吸取1ml加入另一盛有9ml無菌水的試管中，混合均勻，以此類推製成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀釋度的土壤溶液。
4.剛果紅染色法分離（塗布平板）
（1）鑒別培養基的製備
培養基的製備比例如下：
鑒別纖維素分解菌的培養基
CMC-Na 5-10g
酵母膏 1g
KH2PO4 0.25g
瓊脂 15g
土豆汁 100ml
將上述物質溶解後,用蒸餾水定容到1000ml
按以上比例配製200ml鑒別培養基和10mg/ml的剛果紅（CR）溶液，滅菌後，按照每200ml培養基加入1ml的比例往培養基中加入CR溶液，混勻後倒平板，凝固後待用。
塗布平板
將上述已倒培養基的十個平板底麵分別用記號筆寫上10-4,10-5,10-6三種稀釋度（每個稀釋度寫3個）和一個空白平板（留作對照用）。然後用移液器分別由10-4,10-5,10-6三管土壤稀釋液中各吸取0.1ml對號放入已寫好稀釋度的平板中，用無菌塗布器在培養基表麵輕輕地塗布均勻，室溫下靜置5~10min，使菌液吸附進培養基。30℃倒置培養，至菌落長出，產生纖維素酶的菌落周圍將會出現明顯的透明圈。
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