霍亂弧菌及其檢驗

 

1．分類

 

（1）血清分型 霍亂弧菌（V.cholerae）有不耐熱的H抗原和耐熱的O抗原。前者為共同抗原，特異性低，後者具有群特異性和型特異性，是霍亂弧菌分群和分型的基礎。根據O抗原的不同，霍亂弧菌現有155個血清群，其中僅O1群和O139群引起霍亂。O139血清群是新出現的型別，與O1群抗血清無交叉反應，但可與O22和O155血清群產生交叉反應，遺傳學特征和毒力基因與O1群相似。O2血清群～O138血清群可引起人類的胃腸炎，無明顯的季節分布，不引起霍亂流行，不被O1群霍亂弧菌多價血清所凝集，稱之為非O1群霍亂弧菌，以往也稱不凝集弧菌或非霍亂弧菌。

 

O1群霍亂弧菌的O抗原由A、B、C三種抗原成分組成，A是O1群的群特異性抗原，通過三種抗原成分的不同組合可分成三個型別:AB構成小川型、AC構成稻葉型、ABC構成彥島型。彥島型的抗原性不穩定，各型之間可以相互轉換，以小川型和稻葉型為常見流行型別。

（2）生物型 根據生物學特性，O1群霍亂弧菌可分為古典生物型和El-Tor生物型，兩個生物型具有相同的血清型。El-Tor生物型是具有溶血性的生物型，現發現El-Tor生物型細菌在環境中的抵抗力、存活力更強，在我國流行的以El-Tor小川型為主。

 

（3）噬菌體分型 根據霍亂弧菌對噬菌體的裂解模式不同進行分型，得到32個型，其中第Ⅳ組和第Ⅴ組噬菌體較為實用，前者以裂解古典生物型為主，後者僅對El-Tor生物型有高度特異性。

 

2．細菌特性

（1）形態染色 革蘭染色陰性，呈弧形或逗點狀，菌體尾端有一鞭毛，運動活潑，懸滴鏡檢可見穿梭狀運動，患者糞便直接塗片可見弧菌縱列呈“魚群”樣，O139群弧菌亦為單端單鞭毛，有莢膜。

（2）培養特性 需氧或兼性厭氧菌，在16～44℃均可生長，最適生長溫度37℃；營養要求不高，在普通培養基上生長良好，耐堿，在pH6.8~10.2範圍均可生長，一般增菌培養常用pH8.4～8.6的1％堿性蛋白腖水進行選擇性增菌。常用的選擇性培養基有硫代硫酸鈉-枸櫞酸鹽-膽鹽-蔗糖瓊脂平板（TCBS平板），霍亂弧菌發酵蔗糖產酸，菌落呈黃色；4號瓊脂和慶大黴素瓊脂平板，因含亞碲酸鉀，霍亂弧菌在其上生長將培養基中的碲離子還原成元素碲，形成灰褐色菌落。血平板上菌落較大，El-Tor生物型可形成β溶血環。可在無鹽培養基上生長，但在含有高於60g/L氯化鈉的培養基上不能生長；O139群霍亂弧菌能在無鹽及30g/L氯化鈉蛋白腖水中生長，不能在80g/L濃度下生長。

（3）生化反應 氧化酶、明膠液化和吲哚試驗陽性，發酵蔗糖和甘露醇，賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶陽性，精氨酸雙水解酶陰性。霍亂弧菌古典生物型和El-Tor生物型的區別見表12-1。

 

                   表12-1 霍亂弧菌古典生物型和El-Tor生物型的區別

 

 

注：+，≥90％陽性；-，≥90％陰性；D，10%～89%陽性。

（4）抵抗力 霍亂弧菌對幹燥、熱、酸和消毒劑均敏感，但在自然環境中存活時間較長， O139群霍亂弧菌在水中存活時間較O1群霍亂弧菌長。

3．臨床意義

霍亂弧菌O1群和O139群是烈性腸道傳染病霍亂的病原體。在自然情況下，人類是霍亂弧菌的易感者。人通過攝入霍亂弧菌汙染的食物或水，引起霍亂。進入腸道的霍亂弧菌通過鞭毛運動穿過腸黏膜表麵的黏液層，接近腸黏膜上皮細胞，通過普通菌毛的作用定植。腸道內的環境有利於霍亂弧菌的繁殖，產生霍亂腸毒素，導致疾病的發生。

霍亂弧菌的主要致病因素是霍亂毒素（cholera toxin，CT），CT是目前已知的致瀉毒素中最強烈的毒素,可造成腸液大量分泌，導致嚴重的嘔吐和腹瀉，使體內水分和電介質大量丟失，形成嚴重的水樣腹瀉綜合征。

 

4.微生物學檢驗

 (1)檢驗程序

(2) 標本采集 霍亂是烈性腸道傳染病，檢驗標本主要以病人的大便為主，必要時嘔吐物和被嘔吐物汙染的衣褲亦可作為標本。一般采取新鮮糞便，或用棉拭子插入直腸內4～5cm采取。病人標本最好床邊接種，預計能在3h內進行培養者，可將肛拭子置於滅菌的含堿性蛋白腖水的試管中，或將10～15ml大便放在帶蓋的廣口瓶中，送往實驗室。不能在3h內進行接種或需送至較遠實驗室的，應將標本轉至卡-布半固體運送培養基中送檢，避免使用甘油鹽水緩衝運送培養基。送檢標本應密封並派專人送達。

（3）檢驗方法

1）顯微鏡檢查 ①塗片染色:取病人“米泔水”樣或黏液絮狀糞便標本直接塗片，革蘭染色或1：10稀釋複紅染色，鏡檢；一般新鮮糞便中弧菌較典型，排列呈“魚群”狀，菌株隨人工培養傳代次數增加或菌落放置過久而逐漸變為不典型的短杆狀；②動力觀察：可用懸滴法、壓滴法或暗視野顯微鏡觀察動力，霍亂弧菌運動活躍，新鮮糞便標本中常呈“穿梭樣”或“投標樣”運動；③製動試驗：將病人“米泔水”樣糞便或6h的增菌液0.25ml同0.25ml適當稀釋的霍亂多價“O”免疫血清混合，5min後作暗視野或懸滴法檢查，並以生理鹽水與標本混合作為對照，有免疫血清存在時，菌體凝集成塊，動力消失；④直接熒光抗體染色檢查和O1群抗原單克隆抗體凝集試驗，可快速診斷霍亂弧菌感染。

2）分離培養 將標本直接接種於堿性蛋白腖水，或將運送培養基的表層接種於堿性蛋白腖水中35℃6～8h後，轉種至TCBS瓊脂或4號瓊脂或慶大黴素瓊脂平板，35℃培養12～18h觀察菌落形態，TCBS上出現黃色菌落，4號瓊脂或慶大黴素平板上出現灰褐色中心的菌落，均為可疑菌落，應使用O1群和O139群霍亂弧菌的多價和單價抗血清進行玻片凝集試驗，結合菌落特征和菌體形態，作出初步報告。

將與抗血清凝集的菌落進一步純培養，依據全麵的生化反應、血清學分群及分型進行最後鑒定。符合霍亂弧菌的菌株尚需區分古典生物型和El-Tor生物型（表12-1）。

3）鑒定 用於霍亂弧菌的鑒定試驗有：①霍亂紅試驗:霍亂弧菌的兩種生物型均呈陽性反應，但是，本反應並非霍亂弧菌特有，許多能分解色氨酸和還原硝酸鹽的細菌，均能產生陽性反應；②糖發酵試驗:霍亂弧菌分解葡萄糖、蔗糖、甘露醇產酸不產氣，不發酵阿拉伯糖；③粘絲試驗:弧菌屬細菌除副溶血弧菌部分菌株外，均有此反應；④O/129敏感試驗：參照藥敏試驗方法進行。將O/129 10μg和150μg的紙片貼在接種有待測菌的瓊脂平板上，35℃孵育18～24h後，紙片周圍出現任何大小的抑菌環均為敏感；O1群和非O1群霍亂弧菌均敏感，但已有對O/129耐藥的菌株出現；O139群對O/129耐藥，用此試驗作鑒定時需特別謹慎，需結合其他試驗結果加以綜合考慮；⑤耐鹽試驗:霍亂弧菌可在不含氯化鈉和含有6％氯化鈉培養基中生長，氯化鈉濃度高於6％則不生長。

4）霍亂弧菌的生物分型試驗 見表12－1，這些試驗中，每種試驗都可能或多或少地存在例外情況，可根據實驗室具體情況采用數種試驗，多數符合，一般情況下即可判定霍亂弧菌的這兩個生物型。

（4）耐藥性 致病性弧菌在MH培養基上生長良好，可用NCCLS規定的紙片擴散法進行體外抗生素藥敏試驗，常規測定氨苄西林、四環素、氯黴素、SMZ-TMP、呋喃唑酮。對於具有自限性的腹瀉而言，體外藥敏試驗並非必需，但對監控弧菌的耐藥性發展趨勢有意義。

（5）結果與報告 霍亂屬於法定的甲類傳染病，一旦從病人糞便標本中分離出霍亂弧菌，需立即向上級管理部門報告。