細菌培養檢測技術（2）

五、接種操作區
　　為避免在接種過程中汙染環境以及空氣中的細菌汙染培養物，接種均應在接種罩或無菌室內進行，此外細菌學實驗室所必需的設備還包括無菌工作台、生物安全櫃和生物安全實驗室。
　　（一）接種罩　接種罩的式樣很多，可用木框和玻璃製成，亦有用有機玻璃製成。接種罩在用前先以3％石炭酸或來蘇輕拭，內需裝有紫外線殺菌燈，用前可先行照射，以保證罩內無塵埃和細菌。操作結束後，應立即清理內部，並作罩內消毒處理。
　　（二）無菌工作台　又稱超淨工作台（super clean bench），目前多采用垂直層流的氣流形式。通過變速離心風機將負壓箱內經過預濾器過濾的空氣壓入靜壓箱，再經高效過濾器進行二級過濾，從出風麵吹出的潔淨氣流，以一定的和均勻的斷麵風速通過工作區時，將塵埃顆粒和微生物顆粒帶走，從而形成無塵無菌的工作環境。使用時應提前50分鍾打開紫外線殺菌燈，30分鍾後關閉並啟動送風機。淨化區內嚴禁存放不必要的物件，以保持潔淨氣流型不受幹擾。
　　（三）無菌室　無菌室又稱潔淨室（clean room），是在實驗室內部安裝的用於無菌操作的小室。室內應有空氣過濾裝置、紫外線殺菌燈等。
　　（四）生物安全櫃 （biological safety cabinet，BSC）目前微生物試驗中多采用生物安全櫃，是為操作原代培養物、菌（毒）株以及診斷性標本等具有感染性的實驗材料時，用來保護操作者本人、實驗室環境以及實驗材料，使其避免暴露於上述操作過程中可能產生的感染性氣溶膠和濺出物而設計的負壓過濾排風櫃。
　　（五）生物安全實驗室（Biosafety Laboratory），簡稱“BSL實驗室”，是指通過規範的實驗設計、實驗設備的配置、個人防護裝備的使用等建造的實驗室。在結構上由一級防護屏障（安全設備）和二級防護屏障（設施）構成，實驗室生物安全防護的安全設備和設施的不同組合，構成了四級生物安全防護水平，一級為最低。
　　 六、接種法
　　根據待檢標本的性質，培養目的及所用培養基的種類，采用不同的接種方法。常用的有平板劃線分離培養法、斜麵接種法、液體接種法和穿刺接種法。
　　（一）平板劃線分離培養法
　　分離培養法就是通過劃線使標本或培養物中混雜的多種細菌在培養基表麵逐一分散生長，各自形成菌落，以便根據菌落形態及特征，挑選單個菌落，經過移種而獲得純種細菌（純培養）。

分離細菌最常用的為平板劃線分離法。
　　1．將接種環火焰滅菌，待冷卻後取標本或混合菌液。
　　2．用左手持起平板，使平皿蓋向上放於台麵上或打開平皿蓋。
　　3．左手斜持（45℃角）平板，右手持已取材的接種環，在酒精燈上方5～6cm處作連續劃線法分離細菌。劃線時，接種環與平板呈30～40°角，輕輕接觸平板，以腕力平行滑動接種環。應避免將瓊脂劃破。先在平板上 l／5處輕輕塗布，然後即可左右來回以作連續劃線接種，線與線間留有適當距離，做到線密而不重複，將整個平板表麵布滿劃線。
　　如果菌量較大可采用分區劃線法。可將平皿分為若幹個區（一般為5個區）。先在平板上 l區輕輕塗布，再在2，3……區劃線。每劃完一個區域，均將接種環滅菌一次，冷後再化下一個區域。每一區域的劃線均接觸上一區域的接種線 l～2次，使菌量逐漸減少，以獲得單個菌落。
   4．劃線完畢，蓋好皿蓋，做好標記將平皿倒置，置37℃培養18～24小時後觀察結果。
　　（二）斜麵接種法
　　主要用於劃線分離培養所獲得的單個菌落的移種，以得到純種細菌和保存菌種，以及觀察細菌的某些培養特性。
　　1．取菌種管置左手食指、中指、無名指之間，拇指壓住管底部上側麵。
　　2．火焰滅菌接種環。
　　3．以右手小指與手掌拔取棉塞（如同時持有兩管，可用小指與無名指拔取另一棉塞），將管口迅速通過火焰 l～2次。
　　4．將已滅菌的接種環伸入菌種管中，從斜麵上取少許菌，迅速伸入待接種的培養基管中，在斜麵底部向上劃一條直線，然後從底部起向上作曲折連續劃線，直至斜麵上方頂端。37℃孵箱中培養18～24小時即可觀察結果。
　　（三）液體接種法
　　肉湯、腖水、發酵管等均係液體培養基。用於增菌，觀察細菌生長現象和檢測細菌的生化反應等。
　　1．持好菌種管及培養基管。
　　2．滅菌接種環，由菌種管取菌，伸入培養基管中，在接近液麵的管壁上方輕輕研磨，並沾取少許培養基液體調和，使接種物充分混合於培養基的液體中。
　　3．液體培養一般以18～24小時觀察生長特征為好。
　　（四）穿刺接種法
　　試管內半固體培養基采用此法接種，多用於保存菌種、觀察動力及做厭氧培養等。亦可用於觀察細菌的某些生化反應。
　　1．持好菌種管和培養基管。
　　2．以滅菌接種針從菌種管取菌。
　　3．接種針直刺入培養基的中心（半固體或一般瓊脂高層）直達管底部（深入培養基3/4處）或沿管壁刺入（醋酸鉛高層），接種後接種針應沿原路退出。
　　4．經培養後即可觀察結果。沿穿刺線生長，線外的培養基清亮者表示細菌無動力；穿刺線模糊不清，或沿穿刺線向外擴散生長，或整個培養基混濁者表示細菌有動力。
　　 七、培養法
　　根據培養目的和細菌的種類選用最適宜的培養方法。常用的有一般培養法、二氧化碳培養法和厭氧培養法。
　　（一）一般培養法
　　一般培養法係指需氧菌或兼性厭氧菌等在需氧條件下的培養方法，故又稱需氧培養法。將已接種好的置37℃孵箱中培養18～24小時。但標本中菌量很少或難於生長的細菌（如結核分技杆菌）需培養3～7天甚至 l個月才能生長。
　　（二）二氧化碳培養法
　　某些細菌的培養，需要5～10%二氧化碳環境中培養才能生長良好。可采用二氧化碳孵箱，它能自動調節二氧化碳的濃度和溫度，使用極為方便。傳統的方法則采用燭缸法，將培養基放入缸內，點燃蠟燭放在缸中，加蓋（塗以凡士林）密閉。因燃燒而產生CO2大約占5～10%，基本可滿足細菌培養的要求。
　　（三）厭氧培養法
　　厭氧菌標本的采集及運送有特殊的要求及注意事項，應避免正常菌群的汙染，盡量少接觸空氣並立刻送檢。厭氧菌的培養法可大致分為：①物理學方法：遮斷空氣法（層積法）、真空法、 空氣置換法、厭氧罐培養、厭氧袋法、厭氧手套箱等。②化學方法：焦性沒食子酸法、硫乙醇酸鈉法、黃磷燃燒法。③生物學方法： 需氧菌共生法、燕麥發芽法。④混合法：真空或氣體置換與焦性沒食子酸法相結合，可根據實際情況選用。