臨床病原體檢查的常用方法（1）

 

感染（infection）是病原體（pathogen）和人體在一定條件下相互作用的病理過程，感染的病原體包括各種細菌、病毒、寄生蟲、真菌、支原體、衣原體、螺旋體等。病原體的來源可分為外源性和內源性感染兩種類型。外源性感染是由於外界的病原體侵入人體，如誌賀菌、結核分枝杆菌、人免疫缺陷病毒（HIV）等引起的感染。內源性感染是人體內經常寄生的微生物，如大腸埃希菌、腸球菌、某些真菌等在一定條件下引起的感染。

 

感染後是否引起感染性疾病（infection diseases）與病原體的數量、毒力和人體的抵抗力有關，並決定感染的發生、發展和結局。病原體感染後機體可以出現不感染、隱性感染（covert infection）、顯性感染（overt infection）、持續性感染（persistent infection）或病原體攜帶狀態（carrier state）幾種類型。感染性疾病是由於感染的病原體毒力強、數量多，超過了機體的抵禦能力，定植在機體一定部位增殖、擴散或蔓延、釋放毒素，引起機體免疫病理反應，導致組織、器官等損傷，生理功能紊亂，並出現一係列的臨床症狀和體征。

 

感染性疾病的檢查主要包括病原體的檢查、感染的血清學試驗等，並由此確定感染性疾病的發生和性質；通過病原體的藥物敏感試驗、耐藥株監測和醫院感染的監測報告，為臨床感染性疾病的最佳治療藥物選擇，采取最有效的預防措施，防止感染的傳播或流行提供及時、有效的實驗數據。

 

下麵介紹臨床病原體檢查的一些常用方法：

 

㈠細菌感染的檢查

 

    1、塗片檢查

 

     臨床標本或分離培養物塗片直接或染色後光學顯微鏡觀察，可為進一步做生化反應、血清學鑒定等提供參考依據。通過顯微鏡觀察有無病原體及其大致數量，病原體形態、染色特征等，可以迅速作出初步診斷，如痰中的抗酸杆菌和腦脊液中的腦膜炎奈瑟菌等。

 

     ⑴不染色標本的檢查     不染色標本一般用於觀察細菌動力及運動情況，因為不染色標本直接在普通光學顯微鏡下，不能清楚看到細菌的形態與結構特征。細菌未染色時呈無色透明，在顯微鏡下主要靠細菌的折光率與周圍環境不同進行觀察。有鞭毛的細菌在鏡下呈活潑有方向的運動，無鞭毛的細菌則呈不規則布朗運動。常用的方法有壓滴法、懸滴法和毛細管法。例如，在高倍暗視野顯微鏡下懸滴米泔樣糞便，觀察到來回穿梭似流星樣運動的細菌；另製備一標本加入O1群霍亂弧菌診斷血清，若來回穿梭似流星樣運動的細菌停止運動，為製動試驗陽性，可報告疑為O1群霍亂弧菌。

 

     ⑵染色標本的檢查

 

     細菌標本經染色後，與周圍環境在顏色上形成鮮明的對比，可在普通光學顯微鏡下清楚看到細菌的形態和某些結構。常用的細菌染色法有：①單染色法隻用一種染料將細菌和周圍物體染成同一種顏色，稱為單染色法。如呂氏美藍或稀釋石炭酸複紅染色法。細菌經單染色法處理後，可觀察其形態與排列、大小及簡單的結構，但不能顯示細菌染色特性。②複染色法用兩種或兩種以上的不同染料進行染色，可將不同細菌或同一細菌的不同結構染成不同的顏色。本法既可觀察細菌的形態結構，還可根據染色反應及著色深淺鑒別細菌的種類，故又稱鑒別染色法。常用的有革蘭染色法（Gram stain）和抗酸染色法(acid-fast stain)。 通過革蘭染色，可將細菌分為革蘭陽性（G+）和革蘭陰性（G-）兩大類，有助於縮小範圍、初步鑒定細菌。例如，在腦脊液塗片中發現G-的腎形、凹麵相對的雙球菌，且在吞噬細胞內或外，則可報告“腦脊液直接塗片找到革蘭陰性雙球菌，形似腦膜炎奈瑟菌”；若發現有革蘭陽性雙球菌，呈矛尖狀、寬端相對尖端向外，且菌體周圍有莢膜，則可報告“腦脊液直接塗片找到革蘭陽性雙球菌，形似肺炎鏈球菌”。

 

 

2、分離培養與鑒定     采集臨床標本在選擇性或非選擇性培養基分離培養，觀察細菌的菌落形態、生化反應、毒素產生等，並用已知特異性抗體的免疫血清鑒定臨床標本中或分離培養物中未知的細菌，確定致病菌的屬、種和血清型（血清學鑒定）等。

 

     ⑴分離培養：①增菌培養：由於標本中的細菌較少，用人工的方法提供生長繁殖所需的營養和最適條件，如溫度、濕度和氣體環境，使其迅速生長繁殖，使菌量增多，供進一步作純培養或分離致病菌。大部分細菌在24~48h內培養生長良好。②分離培養：對於混有多種細菌的臨床標本或其他培養物，經過劃線接種到合適的選擇性或非選擇性固體培養基表麵，因劃線的分散作用，使許多原先混雜的細菌在固體培養基表麵分離，一般經過18~24h培養後形成由一個細菌繁殖而來的細菌集團—菌落（colony），供細菌計數和純培養用。挑選單個菌落，轉種至另一培養基中，生長出來的細菌均為純種，稱為純培養（pure culture）。分離純培養是從臨床標本中檢查鑒定細菌非常重要的第一步，隻有先從含有多種雜菌的標本中分離出目的菌純培養，才能進一步對目的菌予以鑒定和研究。

  

  ⑵鑒定：根據純培養細菌的染色形態、培養生長特性、生化反應和血清學試驗結果，對分離培養的細菌作出鑒定。目前，大多數臨床細菌實驗室多借助自動化細菌鑒定與藥敏試驗係統，可簡便、快速、準確地鑒定各種分離培養的細菌，並同時完成抗菌藥物的敏感性試驗。

 

     3、分子生物學診斷     PCR技術直接擴增病原體基因的保守序列，配合DNA探針雜交、DNA序列分析、基因芯片（gene chip）技術等，檢測臨床標本中或分離培養物中細菌的核酸，可以對感染的細菌作出明確的診斷、分類、基因分型和直接檢測耐藥基因等，菌落原位雜交也常用於快速篩選陽性克隆。特別是分子生物學檢測技術操作的自動化分析儀，如自動化DNA提取儀，定量PCR儀，DNA序列分析儀，脈衝凝膠電泳儀等，使得病原體的分子生物學診斷有可能在臨床常規應用

 

     ⑴細菌的快速鑒定：幾乎所有致病菌的基因都可直接從標本中進行擴增後檢測而不受非致病菌的影響，尤其是對分離培養比較困難的細菌（如結核分枝杆菌）更具特殊意義。目前已用於結核分枝杆菌、沙門菌、誌賀菌、空腸彎曲菌、致病性大腸埃希菌等致病菌的快速鑒定。鑒定各種需氧菌和厭氧菌至種的水平，如鑒別金黃色葡萄球菌、中間葡萄球菌及家畜葡萄球菌，鑒別銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌及熒光假單胞菌，鑒別艱難梭菌、雙酶梭菌及索氏梭菌。

 

     ⑵細菌的分類鑒定：通過對兩菌株DNA雜交百分率判斷其同源性，若＞70%為高度同源性，基因組差別很小；如果兩菌株DNA雜交百分率＜25%為非同源性，兩者不相關。 

 

     ⑶細菌毒素的檢測：細菌的特異性毒素基因序列決定所產生毒素的種類，可用PCR擴增特異的毒素基因片段或直接用其特異性毒素基因探針檢測致病菌的毒素基因，如霍亂腸毒素、金黃色葡萄球菌腸毒素、艱難梭菌毒素等。     ⑷細菌耐藥性檢測：通過擴增細菌的耐藥基因或直接用耐藥基因的探針檢測標本中或純培養細菌有無耐藥基因，可以及早了解細菌對某些抗菌藥物的耐藥性或進行耐藥性研究，如耐甲氧苯青黴素葡萄球菌的mecA基因、耐β-內酰胺抗生素的TEM型β-內酰胺酶基因。

 

 

     ⑸流行病學調查：通過分析流行菌株基因的同源性，可作為流行病學或醫院感染流行菌株調查的依據。