細菌AmpC酶的檢測方法

 

按照Bush-Jocoby-Medeiros分類法(1995),細菌產生的β-內酰胺酶可分四型,其中1型β-內酰胺酶是頭孢菌素酶,由一組位於染色體上的Amp基因編碼並控製。這類酶與超廣譜β-內酰胺酶(ESBL)的區別在於克拉維酸等酶抑製劑對前者並無大的影響,而對後者往往能抑製其活力。前者對頭孢西丁耐藥,而後者相反。1型β-內酰胺酶可分染色體介導和質粒介導，通常具有可誘導性質，一旦形成去阻遏表達則可持續高產此種β-內酰胺酶。1989年Bauernfeid等首次報道在漢城發現的一株革蘭陰性菌的1 型β-內酰胺酶基因位於可轉移的質粒上(質粒AmpC),這種新的耐藥表型因其較快的傳播速度和較強的耐藥性,開始逐漸引起人們的關注，在以每年發現1～2個新酶的速度持續增加。同時在臨床常規藥敏檢測中發現,質粒AmpC對β-內酰胺類藥物的表型有時並不一定耐藥。所以,對於質粒介導AmpC酶的實驗室檢測顯得尤為重要。目前,頭孢西丁三維試驗能檢測AmpC酶。

1.直接法:將試驗菌株製成濁度為0.5麥氏單位的菌懸液,用棉棒均勻塗布於MH平板上。將35mm長的雙麵刀片經火焰消毒後,在已生長試驗菌株的血平板上輕壓,使刀口均勻地沾上試驗菌株。注意不要劃破瓊脂表麵。然後將刀口向下,垂直插入已塗布試驗菌株的MH平板。刀口插入後位置不要移動。再輕輕拔出刀片使MH平板上的刀口切割線自然閉合。刀口菌量不宜過多,以免溢出瓊脂表麵。隨後在切割線中心,距切割線3mm處貼上頭孢西丁紙片。將MH平板放入35℃孵箱過夜。

 

 

2.間接法:將ATCC25922大腸埃希菌製成0.5麥氏單位的菌懸液,均勻塗布於MH平板。其他操作同直接法。

結果判斷:如果試驗菌切割線附近的抑菌圈縮小或變形均提示頭孢西丁失活,為頭孢西丁三維試驗陽性，即1型酶陽性。但這種方法不能區別是誘導酶還是去阻遏表達的酶。

要檢測去阻遏持續高產AmpC酶，可按標準的紙片擴散法操作，將0.5麥氏單位大腸埃希菌ATCC25922菌液塗布於M-H平板上，取30微克頭孢西丁紙片置於平皿中心，使用手術刀片在離紙片邊緣3-5mm處放射狀地由裏向外切割一道狹縫，用微量加樣器取40微升受試菌酶粗提取物由裏向外加入狹縫內，盡量避免酶液溢出狹縫。將MH平板放入35℃孵箱過夜。若觀察到狹縫與抑菌圈交接處出現擴大的長菌區域，視為三維試驗陽性，即AmpC酶試驗陽性。