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微生物檢驗染色技術(2)



錄入時間:2011-6-10 9:20:31 來源:檢驗地帶網

三、製片和染色的基本程序
 
  微生物的染色方法很多,各種方法應用的染料也不盡相同,但是一般染色都要通過製片及一套染色操作程序。
 
1、製片
 
  在幹淨的載玻片上滴上一滴蒸餾水,用接種環進行無菌操作,挑取培養物少許,置載玻片的水滴中,與水混合做成懸液並塗成直徑約1厘米的薄層,為避免因菌數過多聚成集團,不利觀察個體形態,可在載玻片之一側再加一滴水,從已塗布的菌液中再取一環於此水滴中進行稀釋,塗布成薄層,若材料為液體培養物或固體培養物中洗下製備的菌液,則直接塗布於載玻片上即可。
 
2、自然幹燥
 
  塗片最好在室溫下使其自然幹燥,有時為了使之幹得更快些,可將標本麵向上,手持載玻片一端的兩側,小心地在酒精燈上高處微微加熱,使水分蒸發,但切勿緊靠火焰或加熱時間過長,以防標本烤枯而變形。
 
3、固定
 
  標本幹燥後即進行固定,固定的目的有三個:
 
  1)殺死微生物,固定細胞結構。
 
  2)保證菌體能更牢的粘附在載玻片上,防止標本被水衝洗掉。
 
  3)改變染料對細胞的通透性,因為死的原生質比活的原生質易於染色。
 
  固定常常利用高溫,手執載玻片的一端(塗有標本的遠端),標本向上,在酒精燈火焰外層盡快的來回通過3—4次,共約2—3秒鍾,並不時以載玻片背麵加熱觸及皮膚,不覺過燙為宜(不超過60℃),放置待冷後,進行染色。
 
  以上這種固定法在微生物實驗室中雖然應用較多普遍,但是應當指出,在研究微生物細胞結構時不適用,應采用化學固定法。化學固定法最常用的固定劑有:酒精(95%),酒精和醚各半的混合物,丙酮,1—2%的餓酸等。餓酸能很快固定細胞但不改變其結構,故較常用。應用餓酸固定細胞的技術如下:在培養皿中放一玻璃,在玻璃上放置玻璃毛細管,在毛細管中注入少量的1—2%餓酸溶液,同時在玻璃上再放置濕標本塗片的載玻片,然後把培養皿蓋上,經過1—2分鍾後把標本從培養皿中取出,並使之幹燥。
 
4、染色
 
  標本固定後,滴加染色液。染色的時間各不相同,視標本與染料的性質而定,有時染色時還要加熱。染料作用標本的時間平均約1—3分鍾,而所有的染色時間內,整個塗片(或有標本的部分)應該浸在染料之中。
 
  若作複合染色,在媒染處理時,媒染劑與染料形成不溶性化合物,可增加染料和細菌的親和力。一般固定後媒染,但也可以結合固定或染色同時進行。
 
5、脫色
 
  用醇類或酸類處理染色的細胞,使之脫色。可檢查染料與細胞結合的穩定程度,鑒別不同種類的細菌。常用的脫色劑是95%酒精和3%鹽酸溶液。
 
6、複染
 
  脫色後再用一種染色劑進行染色,與不被脫色部位形成鮮明的對照,便於觀察。革氏染色在酒精脫色後用番紅,石碳酸複紅最後進行染色,就是複染。
 
7、水洗
 
  染色到一定的時候,用細小的水流從標本的背麵把多餘的染料衝洗掉,被菌體吸附的染料則保留。
 
8、幹燥
 
  著色標本洗淨後,將標本晾幹,或用吸水紙把多餘的水吸去,然後晾幹或微熱烘幹,用吸水紙時,切勿使載玻片翻轉,以免將菌體擦掉。
 
9、鏡檢
 
  幹燥後的標本可用顯微鏡觀察。
 
  綜上所述,染色的基本程序如下:
 
  製片→固定→媒染→染色→脫色→複染→水洗→幹燥→鏡檢。

 

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