【摘要】利用分離純化微生物的基本操作技術對土壤中的微生物進行分離與純化，根據菌落形態觀察、染色鑒定以及一係列的生理生化試驗的結果通過查閱《伯傑氏係統細菌學手冊》對照種屬特征最終判斷所分離純化的細菌所屬的屬。
【abstract】By several methods and technique, we got the pure cultures of two kinds of bacteria which were separated from soil. According to the results of colony observing, staining, and experiments of physiology and bio-chemistry, we referred to the Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology and finally decided their genus.
【關鍵詞】革蘭氏陽性、芽孢、片球菌屬 、 芽孢杆菌屬
實驗目的：
1、學習從土壤中分離、純化微生物的原理與方法。
2、學習、掌握微生物的鑒定方法。
3、對提取的土樣進行微生物的分離、純化培養，並進行簡單的形態鑒定。
4、對簡單鑒定後的微生物進行生理生化鑒定並由鑒定結果查伯傑氏手冊以確定分離出微生物的品種。
實驗原理：
從複雜的微生物群體中獲得隻含有一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。常用的方法有
1、簡單單細胞挑取法
2、平板分離法
此次實驗采取的是平板分離法，該方法操作簡單，普遍用於微生物的分離與純化。其原理包括兩方麵：
1、在適合於待分離微生物的生長條件（如營養、酸堿度、溫度與氧等）下培養微生物，或加入某種抑製劑造成隻利於待分離微生物的生長，而抑製其他微生物生長的環境，從而淘汰一些不需要的微生物。
2、微生物在固體培養基上生長形成的單個菌落可以是由一個細胞繁殖而成的集合體。因此可通過挑取單菌落而獲得純培養。獲得單菌落的方法可通過稀釋塗布平板或平板劃線等方法完成。
但是從微生物群體中經分離生長在平板上的單個菌落並不一定保證是純培養。因此，純培養的確定除觀察其菌落的特征外，還要結合顯微鏡檢測個體形態特征後才能確定。有的微生物的純培養要經過一係列分離與純化過程和多種特征鑒定才能得到。
土壤是微生物生活的大本營，它所含微生物無論是數量還是種類都是極其豐富的。因此土壤是微生物多樣性的重要場所，是發掘微生物資源的重要基地，可以從中分離純化的到許多有價值的菌株。此實驗將從土壤中分離兩種細菌。
實驗器材、試劑與菌種：
1、器材：
培養皿、載玻片、蓋玻片、普通光學顯微鏡、量筒、滴管、吸水紙、燒杯、三角瓶、電爐、玻璃棒、接種環、鑷子、搪瓷杯、恒溫培養箱、高溫滅菌鍋、移液槍（槍頭）、電子天平、濾紙、pH試紙等。
2、 試劑：
配製牛肉膏蛋白腖培養基的原料（牛肉膏、NaCl、瓊脂、蛋白腖）、配置糖發酵培養基的原料（葡萄糖、K2HPO3、溴百裏酚藍、瓊脂、NaCl、蛋白腖）、甘油（丙三醇）、結晶紫染液、番紅染液、碘液、95％乙醇、5％孔雀綠染液、0.5％番紅水染液、3％過氧化氫水溶液、1％鹽酸二甲基對苯撐二胺溶液、蒸餾水等。
3、 土樣：取自山東大學7號宿舍樓門前土壤，地下10cm左右。
實驗步驟：
1、配製牛肉膏蛋白腖培養基：
1）配製牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基500ml （用於12個平皿和10支試管斜麵）
牛肉膏 0.3% ………………………………… 1.5 g
蛋白腖 1% …………………………………… 5g
NaCl 0.5% ………………………………… 2.5g
瓊脂 2% …………………………………… 10g
pH ………………………………………… 7.0~7.2
2）倒12個平板和10支試管斜麵，包紮，121℃滅菌20min.
2、製備土壤稀釋液：
稱取土樣10g，放入盛有100ml無菌水的帶有玻璃珠的三角瓶中，振蕩搖勻10min 使土和水充分混合，然後用移液槍從三角瓶中吸取1ml（此操作要求無菌操作），加入另一盛有9ml無菌水的試管中，混合均勻，以此類推分別製成製成0.01、0.001、0.0001不同稀釋度的土壤溶液。
3、塗布培養：
以0.01以及0.0001兩個濃度的土壤稀釋液作為塗布平板培養的對象，將其分別塗布在3個牛肉膏蛋白腖培養基中，共6個培養基，標號，37°C溫箱培養48 h。
4、劃線分離（劃線培養）：
對兩種土壤溶液的微生物培養基進行觀察，記錄兩種區分明顯的細菌性狀。挑取此兩種細菌在新的培養基中劃線培養（每種細菌培養3個培養皿），標號、37°C培養。
5、初步鑒定：
對兩種菌進行簡單染色、革蘭氏染色以及芽孢染色觀察，記錄結果。
6、試管斜麵再培養：
將兩種純菌株接種分別接種在5支試管中，共10支試管。37°C培養（18－24h）。
7、對試管中培養的兩種菌進行生理生化鑒定：
1）過氧化氫酶鑒定：
A 實驗原理：
乳酸菌與許多厭氧菌與其他細菌區分的主要依據是鑒定有無過氧化氫酶。該酶可以把過氧化氫分解為水與氧氣，氣體氧以氣泡跑出來，則為過氧化氫酶實驗陽性。乳酸菌和許多厭氧菌在過氧化氫酶實驗中呈現陰性。
B 步驟：
將培養新鮮的待測菌種（培養18－24h內）接在載玻片上，滴一滴3％過氧化氫於菌體上。
2）糖發酵與氧化實驗
A 實驗原理：
在細菌的分類鑒定中，糖發酵與氧化測定是一項重要的依據。絕大多數細菌都可以利用糖類作為能源以及碳源，但由於不同的菌存在酶係的差異，因而對糖類的發酵與氧化的能力就有所不同。有的在糖類發酵與氧化代謝中能分解糖類，產酸產氣，有的則隻能產酸不可以產氣。酸的產生與否，以及是發酵型產酸還是氧化型產酸，可以由預先加在培養基中的指示劑（溴百裏酚藍水溶液）呈現出來。這樣把接好菌種的培養基放在厭氧或好氧的環境下培養，培養基有綠色變為黃色為產酸，是否產氣是通過觀察培養基中是否產生氣泡或培養基斷裂來測定。
B 步驟
① 配置糖發酵培養基150 ml （葡萄糖：、K2HPO3：、溴百裏酚藍、瓊脂：、NaCl：、蛋白腖：），分裝試管。
② 110°C滅菌培養基20 mins （同時滅菌一定量甘油，待用）。
③ 對兩種細菌進行“穿刺”培養，每種菌做5個試管：2個蓋管培養，2個開管培養，一個為蓋管對照組。在培養基的上方加入1－2cm厚的甘油，作為“蓋 管”，以提供菌體無氧的生長環境，開管則不加甘油，作為有氧的生長環境供菌體生長。
④ 在37°C下培養，並在培養24h後觀察培養基中顏色的變化，以及有無氣泡。
3）細胞色素氧化酶測定
A 實驗原理
細胞色素氧化酶是氧化酶的一種，它在有分子氧以及細胞色素C存在時，可以氧化二甲基對苯撐二胺，使之呈現玫瑰紅或暗紅色，在此基礎上還可以與a－苯酚結合生成吲哚酚蘭，出現藍色
B 步驟
在幹淨培養皿中放一濾紙，用火柴棒取培養18－24h的鑒定菌苔黏在濾紙上，滴一滴1％鹽酸二甲基對苯撐二胺溶液於菌苔上，進行觀察。
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