苯酚/氯仿溶液抽提法
1. 接種5ml LB,37℃搖床過夜培養(12小時)
2. 離心,3000rpm,5min去上清
3. 振蕩混勻沉澱,分裝在2個離心管中,spin一下,吸去上清,加入150μl的溶液I (50mmol/L葡萄糖, 25mmol/L Tris•Cl(PH8.0), 10mmol/L EDTA(PH8.0) 在10lbf/in2(6.895×104Pa)高壓蒸氣下滅菌15min(8磅),貯存於4℃),劇烈振蕩5分鍾打散菌體(菌體不打散容易在產物中出現較多蛋白)。
4. 加入300μl溶液II(0.2mol/LnaOH, 1%SDS, 用2倍的溶液現配現用)後立即振蕩混合均勻,處理2分鍾後加入225μl溶液III(5mol/L乙酸鉀 60ml,冰乙酸 11.5ml,水 28.5ml)混合均勻,12000rpm離心5min,取上清液中於新的離心管。
5. 加120μl酸性苯酚/氯仿溶液,振蕩混勻,12000rpm離心5min,再取上清液中於新的離心管中。
6. 用120ul氯仿重複操作5。
7. 加等體積的異丙醇或2倍體積的乙醇,混勻,12000rpm離心7min。
8. 沉澱用70%乙醇洗滌兩次,每次10min。50℃烘幹後加適量無菌去離子水(ddH2O)溶解,-20℃保存。
氯化鋰抽提法
1. 前四部同苯酚/氯仿溶液抽提法(用Solution I II III處理)
2. 加等體積的異丙醇,混勻,沉澱DNA,12000rpm離心7min。去上清,盡量去幹淨。
3.用少量70%乙醇洗一下(洗去異丙醇),離心去盡酒精,50℃烘幹沉澱,用適量ddH2O(100ul)充分溶解(可在50度水浴中助溶)後加入4/5體積的氯化鋰溶液(濃度約10mol/L)處理1min沉澱RNA和蛋白。
4.12000rpm離心5min,取上清液於新的離心管中,用等體積的異丙醇混勻,12000rpm離心8min,去上清。
5. 將沉澱用70%乙醇洗滌兩次,每次10min。50℃烘幹後加一定量的無菌去離子水(ddH2O)溶解,-20℃保存。
酶連反應
一般采用10μl反應體係:
T4連接酶 1μl ,連接酶緩衝液1μl ,外源片段與載體按DNA 摩爾含量3:1加入即可。
如果是粘端連接,則需把外源片段和載體的混合物在50度處理10分鍾使粘端變性,然後立即放入冰中5分鍾。
平端連接采用14度,粘端連接采用16度,連接4小時以上(一般可過夜)。
*外源片段與載體按DNA 摩爾含量為3:1或外源更多。
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