1試劑盒回收 (離心法)
(1) 在長波紫外燈下切下含有目標DNA的瓊脂糖凝膠,用紙巾吸幹凝膠表麵的液體並切小.計算凝膠的重量,該重量作為一個凝膠體積(如1oomg=1ooul)
(2) 根據凝膠的濃度,加DE-A 液
凝膠濃度 DE-A溶液體積
≤1.0% 3個凝膠體積
≤1.5% 4 個凝膠體積
≤2.0% 5 個凝膠體積
混勻後於75℃加熱,(低熔點瓊脂糖凝膠於45℃加熱),間斷混合,直到凝膠熔化(6-8分鍾).
(3)加0.5個DE-A體積的DE-B溶液,混勻(是否需調整PH值,見注意事項1);當分離的DNA片段小與400bp 時,加入異丙醇至終濃度為20%;
(4)吸3中的混合液,轉移到DNA製備管,3600rpm離心1分鍾.如製備管中有殘留,適當提高速度,再離心1分鍾,去濾液;
(5)將製備管置回離心管,加0.5ml W1溶液,3600rpm離心30,棄濾液;
(6)將製備管置回離心管,加0.7ml W2溶液,3600rpm離心30,棄濾液,重複一次; （W2中含有酒精，應保證瓶子密封。）
(7)將製備管置回離心管,最高速度離心1分鍾;
(8)將製備管置潔淨的1.5 ml 離心管中,在DNA製備膜正中央加25ul水或洗脫液,室溫靜置1分鍾.最高速度離心1分鍾洗脫DNA.
注意事項;
1.此法適合從TAE或TBE瓊脂糖凝膠中回收DNA,用其他緩衝液時,加DE-B溶液後,溶液的PH要調整到6.5以下.
2. 勿將DNA長時間暴露在高溫下,線型DNA於高溫條件下易水解.勿將凝膠長時間暴露在紫外燈,減少紫外燈對DNA的損傷.
3. 2步驟中的凝膠必須完全熔化,否則將嚴重影響DNA的回收效率.
4. 步驟4中吸回濾液到DNA製備管中再吸附一次,可提高回收效率.將洗脫液或水加熱到60℃,可提高回收效率。（重要）
5. DNA分子呈酸性,建議在洗脫液中保存。（試劑盒中提供的洗脫液好像對PCR有某種抑製作用。）
2 silica回收
1 在長波紫外燈下切下含有目標DNA的瓊脂糖凝膠, 用紙巾吸幹凝膠表麵的液體並切小.計算凝膠的重量;
2. 加入2-3倍體積的6M KI或NaI（避光4度保存）;
1. 65℃溫浴, 間斷混合,直到凝膠熔化;
2. 加適量的振勻的silica懸液（10ul）充分混勻, 冰上放置15分鍾（或更長）,間斷混合;
3. 5000rpm離心3分鍾, 棄上清;
4. 加1ml預冷的NEW buffer（先用100ul打散沉澱，再用900ul混勻），冰上 洗鹽2 分鍾，間斷混合;
5. 12000 rpm離心10s, 棄上清;
6. 重複6,7步驟1次;
7. 於50℃烘箱烘幹;
8. 加10ul的去離子水用槍頭打勻,65℃水浴15分鍾,間斷混勻;
9. 12000 rpm離心10 s，把上清轉移到另外潔淨的離心管中;
10. 跑膠檢測回收效率.
注意事項
＊ 4----8步均在冰上操作，防止解吸附，silica隻在低溫下對DNA有吸附作用。
＊ NEW Buffer：（100ml）
1ml 5M Nacl, 1ml 1M pH7.5 This-HCl, 0.5ml 0.5M EDTA, 50ml 100% ETOH, 去離子水加至100ml。（-20度保存）
＊ Silica配法見：TIG January 1995 Vol.11 No. 1. An inexpensive alternative to glassmilk for DNA purifyication.
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