食品中黴菌和酵母分布、檢測和鑒定（2）

 

4．黴菌和酵母總數測定

4.1 基本要求：黴菌培養應用專用培養箱，培養溫度在25～30℃之間對結果影響不大。為盡快得到結果，我們以27℃為培養溫度。菌落計數應於培養後的72小時進行第一次觀察。這時主要是觀察那些密集生長的平皿，以免到第五天之後，菌落生長成片而難以計數。

 

　　實驗時手腳要快，動作宜輕，培養過程中觀察平板時，動作稍重，生長快速的黴菌孢子就會在培養基內擴散，導致二次汙染，結果讀數異常。特別是翻轉平板進行培養，觀察時再轉過來，特別容易導致孢子飛散。一般以第五天的讀數為最終計數。但觀察應持續七天。

 

　　由於黴菌和酵母菌落較大，光線正常時可以方便地計數。選擇那些黴菌數為10～100個之間的平皿計數，而不是象細菌的30～300個。有時10～50個菌落的平皿也是受肯定的。

 

黴菌和酵母培養時間較長，用於傾注的培養基量應稍多於細菌計數，約為15～20 mL，以保證培養時不至於造成培養基過分幹燥。培養箱內溫濕度調節不當，會造成黴菌蔓延生長或培養基失水。尤其是當濕度過高時，常導致嗜濕的根黴、木黴、毛黴、鏈孢黴等的強烈汙染。當然，每批實驗時空白對照都是要做的。

 

4.2 黴菌和酵母計數培養基

傳統黴菌和酵母計數時用酸性培養基來抑製細菌。酸化的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）是一致公認最好的酸化培養基。用酸，如酒石酸調pH至3.5後用於計數，效果尚令人滿意。酸化培養基也有無法避免的缺點，如黴菌菌落的擴展，耐酸細菌的生長，蛋白質出現沉澱，以及抑製了不耐酸黴菌和酵母的生長等。最後還有一點，生長在酸化培養基上的黴菌和酵母形態異常，不利於分類鑒定。

 

目前普遍使用抗生素培養基，上述缺點明顯改善。此方法經濟有效，培養基易製備，不會破壞正常的菌落形態。常用的抗生素類藥物有氯黴素（50～100 mg／kg）、土黴素（100 mg／kg）、硫酸慶大黴素（50 mg／kg）、鏈黴素（3 g／kg）、鹽酸金黴素（20 mg／kg）等。兩種抗生素合並使用效果更好。硫酸慶大黴素和氯黴素耐高壓，可以預先添加在培養基中一起滅菌，而其他的抗生素一般在培養基溫度降至50℃以下後添加。注意，抗生素效用在堿性條件下（pH＞8.0）降低。

 

　　孟加拉紅（Rose of Bengal）常被用於製備黴菌和酵母的計數瓊脂。主要作用是限製黴菌菌落的蔓延生長，而不是象某些書本所描述的那樣，用於抑製細菌。孟加拉紅也被稱為虎紅，化學名是四碘四氯熒光素鈉鹽或鉀鹽。添加孟加拉紅的培養基上生長的黴菌菌落較為致密，而且生長的菌落背麵顯出較濃的紅色，有助於計數。唯一的缺點是孟加拉紅溶液對光敏感，易分解成一種黃色的有細胞毒作用的物質。平時應將孟加拉紅溶液用不透光的容器或袋子包好，貯存在冰箱中。已變黃的溶液和瓊脂應棄去。著名的應用孟加拉紅的培養基是馬丁瓊脂（Matin's Media，亦稱虎紅瓊脂、孟加拉紅瓊脂）。孟加拉紅可添加在PDA中。鄰氯對硝基苯胺（2 mg／kg）有類似孟加拉紅的作用。國外學者也常用孟加拉紅瓊脂，其中添加孟加拉紅25 mg／kg，另外附加鄰氯對硝基苯胺2 mg／kg，氯黴素50 mg／kg，金黴素50 mg／kg。美國FDA尚未認可孟加拉紅瓊脂，它的標準仍以PDA的酸化法和抗生素法為基本。

 

國家標準規定，黴菌和酵母數檢驗時使用的培養基為孟加拉紅瓊脂和馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）。原標準隻要求做糧食黴菌總數時，使用高鹽察氏瓊脂。高鹽察氏瓊脂使用時也有抑製力過強的缺點，而毛黴和根黴等卻仍然生長旺盛。一般使用CAO時，應同時使用孟加拉紅瓊脂，以反映食品真菌的菌相全貌。現在高鹽察氏瓊脂已廢止。不過，標準中忘記刪除流程圖中的CAO。察氏瓊脂（Czapek）和PDA通常隻用於分類鑒定。

 

　　當酵母為優勢菌群時，使用MEGA計數。配方：麥芽浸膏20克，蛋白腖1克，葡萄糖20克，瓊脂20克，蒸餾水1升，調pH 5.4，121℃15 min，添加50 mg/kg氯黴素和金黴素以抑製細菌。如買不到麥芽浸膏，可以向啤酒廠購買麥芽汁（未添加啤酒花，without hops）代替。上述培養基均有幹粉出售。使用時十分方便，但各品牌的質量不一。

 

4.3 黴菌和酵母計數方法

　　稀釋平板法最常用於食品樣品的檢驗。國家標準種樣品處理等方法與細菌的菌落總數計數方法大致相同。事實上，可以在進行菌落總數計數的同時，進行黴菌和酵母總數的檢驗。兩者之間的差異為培養基和培養溫度的不同。

 

有人認為，黴菌和酵母計數用表麵塗布平板法能提高檢出率，因為黴菌有氣生菌絲，好氧性強，酵母耐熱性差，不耐融化瓊脂的熱力。而且可用不透明的培養基。檢驗方法同細菌檢驗常規，不再贅述。但因使用樣品量較少，對含菌量少的樣品，此法可能不夠準確。

 

對於國家標準中規定的黴菌直接計數方法，引用了著名的霍華德（Howard）黴菌計數法，適用於檢驗番茄及其加工製品，但是需要專門的技術培訓和相應設備。

 

5. 黴菌和酵母分類鑒定

黴菌中的多數種類不會產生有害的黴菌毒素，危害較小，而少數菌株即使汙染數量不多，產生的黴菌毒素卻有極大的危害，因此單純的黴菌和酵母計數並不能反映食品的安全性，隻有知道了食品的汙染菌菌相，才能更準確地判斷。分類鑒定的意義就在於此。但是，黴菌和酵母的分類鑒定十分繁瑣。

 

5.1 分離和純化：常用方法有直接點種法、劃線法、稀釋平板法。稀釋平板法同常規檢驗，除了培養基用具選擇性的外，還要求每皿中長出的黴菌菌落在十個左右，太多則影響分離效果。另外，如采用傾注法，長在瓊脂深處的黴菌發育不良，無法觀察其菌落特征。可改用表麵塗布法。此方法手續繁瑣，但所得種類較多。直接點種法將食物小顆粒直接種於分離培養基上，25℃培養2～3天後，用接種針挑取孢子或菌絲，轉接於適當的瓊脂斜麵上待鑒定。此方法分純效果略遜。劃線法是用無菌水洗滌樣品，用接種環沾取液體在分離培養基上劃線分離。此法最簡便，但可能遺落部分菌株。

 

5.2 真菌分類係統：全世界已知真菌有上千屬，十萬種。四十年多來，真菌的研究飛速發展，盡管在真菌超微結構、生理生化、醫學真菌學、藥用真菌學、真菌毒素、食用真菌人工培養開發等方麵已經獲得了很多進展，但是，真菌學仍然是微生物學的薄弱環節，還有待進一步深入研究。目前，在係統學方麵，受到公認的分類體係不多。

 

5.3 酵母分類鑒定：酵母在真菌分類係統中分別隸屬於子囊菌綱、擔子菌綱和半知菌類。為方便起見，國際上仍沿用酵母（Yeast）這個非分類學名詞。酵母分類以荷蘭Lodder J.主編《The Yeast－A Taxonomic Study》(羅德，酵母—分類研究)1970年再版本為比較完整的係統。

 

鑒定一株酵母，要花費極大的人力物力。因其形態和生理方麵的試驗項目繁多，一般微生物實驗室難以開展。分離酵母時，現在一般不用低pH培養，而以抗生素抑製細菌。嗜幹酵母常規方法很難檢出，因其要求低水活度，可以用濃縮果汁為培養基，或添加30％葡萄糖，稀釋樣品時也用30％葡萄糖溶液。濃縮果汁中此類菌數量不得超過1/50 mL。在檢查分離抗防腐劑的酵母時，培養基添加0.5％醋酸能促進抗保鮮劑酵母的生長並抑製其他酵母。

 

　　鑒定時，先根據細胞形態特征進行屬以上的判斷，如是否有性繁殖，子囊孢子、擲孢子、冬孢子和擔孢子數量、形態，無性生殖是出芽還是裂殖，有無假菌絲等等。種的確定主要以生理特性，尤其是糖類發酵或同化為依據，還要包括無維生素生長、酯酶活性、色素形成、同化硝酸鹽、酯類產生情況、對放線菌酮抗性、低水活度生長等等生理特點，常常需要數周後才有鑒定結果。

使用API 20C或Biolog全自動細菌分類係統等可以大大加快檢索鑒定速度。目前，上述設備及類似設備研製較多，但普及有一定難度，主要原因是其價格居高不下。這種全自動或半自動檢索代表了今後微生物分類研究的發展方向。

 

5.4 黴菌分類鑒定

5.4.1 黴菌分類培養基：絲狀真菌沒有完整的分類係統，常用Smith係統。黴菌培養時常因不同的培養基而在生理和形態方麵表現出極大的差異，故描述菌種時應注明鑒定培養基。最為常用的是察氏瓊脂和馬鈴薯葡萄糖瓊脂，通常對青黴、曲黴菌種用察氏瓊脂培養，其他黴菌則應選用PDA。對於鐮刀菌屬的菌種，必要時要選用六種以上的不同培養基來分別顯示它的不同培養特征。對有特殊要求的黴菌，培養時也應滿足其條件，低水活度食品如果醬、糧食中的嗜幹黴菌，應使用大量添加蔗糖或食鹽的高滲培養基。

 

5.4.2 培養時間：直接采用黴菌和酵母計數後的平板進行黴菌分類鑒定是可行的。但在培養5～7天時，菌種的形態特征不明顯，不容易觀察。通常於培養7～14天時鑒定。

 

5.4.3 染色液：製片時染色液是必需的。常用兩種：乳酸品紅液（百萬分之一酸性品紅乳酸溶液），染色速度快，尤其是幼齡組織上色快。胞壁組織清晰，適於顯微攝影。1896年 Amann 氏發明的乳酸苯酚棉藍染色液（10克石炭酸溶於10 mL熱蒸餾水，再加入甘油20 mL、乳酸10 mL、棉藍cotton blue 0.22克即成），折光率好，背景微藍，細胞不變形，殺菌防腐防腐，且不易幹燥，保持時間較長。

 

5.4.4黴菌鑒定程序：黴菌分類的困難關鍵在於培養特征的觀察和描述。使用檢索表時一定要對每一分類特征判斷清楚，以免因一次錯誤而誤入歧途。經常進行黴菌分類鑒定的單位或部門需要專人負責這項工作，臨時人員是無法勝任的。

 

鑒定時先肉眼觀察平板上生長的單個菌落，注意菌落顏色、質地等。然後用顯微鏡由低倍鏡、高倍鏡至油鏡觀察，注意菌絲形態、孢子梗、分生孢子和有性器官顏色、形態等。這是鑒定時一定要仔細觀察的指標。

 

　　以曲黴鑒定為例。先進行察氏瓊脂觀察。曲黴在察氏瓊脂上顏色和形態分化較好。根據菌落有無綠色調產生分成兩大類。有時需要放幾天才出現綠色，有的則在幾周後褪去綠色。通常於培養7～14天時觀察。分生孢子頭幼齡與老齡時形態差別很大。可將生長待測菌株的平板或試管斜麵直接置低倍顯微鏡下，先尋找分生孢子頭，然後分別觀察其初生與老齡的孢子頭形態及孢子排列方式。分生孢子梗有光滑、粗糙、凸起、小刺等，有的極長。注意區別頂囊下麵的縊縮和折痕。觀察分生小梗列數時必須用油鏡。用接種針挑取菌絲及孢子頭，用染色液製片。同時，注意分生孢子形態，常見有球形、橢圓形、棒形、菱形等，還要注意表麵是否光滑、刺、疣突等。有時，也要注意如殼細胞、閉囊殼、菌核有無及形態等。

 

　　逐一判斷上述項目，按檢索表可查出曲黴種屬。有時，一種菌能形成兩種孢子，如單互隔黴屬、根串珠菌屬、鐮刀菌屬、發蘚菌屬、毛葡菌屬。應認真觀察。

 

6．真菌實驗室注意事項

考慮到黴菌孢子容易飛散而造成汙染，黴菌和酵母檢驗應在單獨的實驗室中進行。盡量保持實驗室安靜，減少空氣流動。由於黴菌實驗室不能使用布或類似的纖維材料的窗簾，故應提醒操作人員不能在直射陽光下配製、分裝稀釋液、傾注平板以及取樣，最好能安排流水作業，以使從稀釋第一份樣品到傾注最後一個平皿所用時間不超過20 min。由於黴菌所固有的蔓延生長特性，保存菌種不應使用棉塞，以免造成菌種交叉汙染。耐高壓的塑料套式試管帽可以選用。

 

每次實驗前，對有可能導致黴菌汙染的材料，應認真全麵消毒。做完實驗後，尤其是大量培養後，除在第一時間將黴菌培養物滅菌外，還要對培養箱、接種箱、實驗室進行消毒。黴菌孢子對紫外線抵抗力較強，所以通常以甲醛熏蒸，嚴重汙染時可用10％甲醛噴霧。有文獻推薦使用1％五氯酚鈉噴布，可維持十五天藥效。

 

另外，對所使用的菌株致病性或產毒能力應有充分的了解，並作好相應的防護工作。