大腸杆菌的保存和培養

 

一．菌種的保存

重組 DNA 分子(質粒、噬菌體、粘性質粒)必須導入宿主菌中，通過細菌培養來擴增所需的重組 DNA。

通常采用宿主菌是大腸杆菌，根據不同載體需求，選用不同品係大腸杆菌

 

1. 概述：大腸杆菌其它微生物一樣，都具有穩定遺傳性和變異性、遺傳性，保證微生物本身特征的相對穩定，即無性繁殖過程中能夠保持原有的性狀，為菌種保藏提供了有利因此，而變異性，使微生物的性狀在繁殖過程中出現某些改變，給菌種保藏帶來了困難。由於存在變異，即菌種常出現所謂的退化，主要指理想性狀的喪失，從而導致發育緩慢，存活率和產質量降低等現象，菌種保藏工作就是使菌種的變異降低至最小水平，使菌種在較長期的保藏之後仍然保持著原有的生命力、優良生產性能、形態特征以及不汙染雜菌。能夠長期在研究上應用。

 

2. 微生物的變異速度，通常情況下，與其新陳代謝速度有關，微生物代謝活力旺盛，它的變異速度快，代謝活動微弱，變異速度就慢。並且在多次的無性繁殖過程中可能會有突變的積累。人們利用這一規律，可以創造各種條件，使微生物活動處於微弱活動或不活動狀態，以減少變異的發生。

 

3. 菌種保藏的原理是：通過低溫、幹燥、隔絕空氣和斷絕營養等手段，以達最大限度地降低菌種的代謝強度，抑製細菌的生長和繁殖。由於菌種的代謝相對靜止，生命活動將處休眠狀態，從而可以保藏較長時間。要求保存的菌種在複蘇後除保持以前的生活與繁殖能力、不發生形態特征、生理狀態及遺傳性狀的

改變外，還不允許汙染任何雜菌。此外，在保存前應確保菌種的單純性，先分離單菌落後進行鑒定，然後再繁殖保存。

 

4. 常用的長期保存法有：液體石蠟法、矽膠保存法、加入甘油或二甲基亞碸（DMSD）等保護劑。

 

5. 甘油低溫保存法(－70℃—－196℃)的特點

i.

甘油菌低溫保存的基本原理是：在-70℃或液氮中凍存，細菌內的酶活性均己停止，即代謝處於完全停止狀態，故可以長期保存。在0℃—-70℃溫度範圍內，水晶呈針狀，極易招致細菌的嚴重損傷。用電鏡觀察，可見細菌的核膜上有大量針尖樣小孔。因此，為了避免0℃—-70℃冰晶的形成和細菌膜兩側離子平衡的破壞，需要加保護劑。甘油可降低冰點，在緩慢的凍結條件下，能使細菌內水分在凍結前透出細菌外。貯存在-70℃以下低溫中能減少冰晶形成，甘油對細菌無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細菌.

ii.

使用濃度範圍為15%-50%，一般常用30%。在保存瓶中按1：1加入60%的甘油和菌液，混勻後貯存於-70℃或液氮中。複蘇後細菌仍能生長，活力不受任何影響。

 

二、菌種的複蘇

複蘇菌種時，用接種環或牙簽挑取少許凍結的菌種到平皿上，37℃培養8-12小時即可。甘油菌從冰箱取出使用時應置於低溫或 0℃冰浴中，用完盡快放回，接種時挑取表麵已融化部分即可，不可全溶，因反複凍融會導致細胞壁破裂。

 

切記：接種過程中不得使保存瓶中的菌液融化。

 

三、大腸杆菌培養

 

1.培養基配製：培養基從形態上分為液體與固體培養基。根據有無抗生素和其他選擇性藥物分為普通與選擇培養基，常用LB培養基。

1）LB（Luria-Bertain)液體培養基配製

精解蛋白腖(bacto-tryptone)1.0%

酵母浸出粉(bacto-extract)0.5%

氯化鈉1.0%

 

攪拌使之完全溶解，用5molNaOH(about0.2ml/1000ml培養基）調pH至7.0，如用進口試劑可不

必調， 高壓滅菌20min(120℃ 0.1Mpa)

 

2）含瓊脂的固體培養基配製

（1）普通培養基:固體培養基是在液體培養基中加 1.5%瓊脂製成，先配液體培養基，然後加入 1.5%瓊脂，高壓滅菌20min，取出後再無菌狀態下鋪平板

（2）選擇性培養基:將消毒好的固體培養基置室溫下冷卻50℃時加抗生素或其他必加成分，搖勻後倒入滅菌皿中厚度2-3mm, 室溫固化。 (抗生素用三蒸水溶解後，用無菌濾頭過濾到無菌瓶中, 氨苄青黴素終濃度 50μl/ml)新製備的固體培養基較濕，鋪上的液體不易吸收，可在室溫下放 2-3天，或37℃放半小時，然後4℃保存備用。

（3）LB培養基中所用抗生素終濃度：氨苄青黴素-50μl/ml；氯黴素-20μl/ml；慶大黴素-15μl/ml；卡那黴素-30μl/ml；春日黴素-1000μl/ml；壯觀黴素-100μl/ml；鏈黴素-30μl/ml；四環素-12μl/ml。

 

注意：除了四環素保存-20℃，其餘均應保存4℃，所有抗生素均應溶於無菌去離子水。四環素對光敏感

 

 

2.液體細菌培養

1）小量培養:

(1) 取滅菌 16 或 18mm 口徑培養管，加 3-5mlLB 培養基，再加 50mg/ml 氨苄青黴素 3-5ul（宿主菌不加抗生素）

(2) 無菌牙簽挑取單菌落，送入培養液中，或取菌液 5-10ul，轉入培養液中，封好管口

(3) 37℃搖床培養 100-200r/min 至生長飽和，約 6-12 小時

2）大量培養:取 500ml 培養瓶內裝培養基 100-200ml，及相應抗生素。以 0.5-1%濃度接種菌液，37 度搖床培養100-200r/min至OD值0.6-0.8。

 

 

3.固體細菌培養: 用於單一菌落的挑選，轉化後抗性菌落的篩選。

方法：采用劃痕接種法。用接種環從菌種中沾取少量菌液，劃線。