微生物纖維素酶分子生物學研究進展

摘要:概述了近二十年來纖維素酶分子生物學的研究情況 ,包括纖維素酶合成調控、纖維素酶基因結構、基因複製及纖維素酶合成調控。

 

關鍵詞:纖維素酶;分子生物學;進展

 

        纖維素是世界上最豐富的再生能源 ,約占生物總量的 50 % ,但由於其組成結構的複雜性 ,轉化利用纖維素一直是個問題。現在人們渴望通過纖維素酶的研究開發來解決 ,對其 分子生物學的研究是一重要方麵。

 

1 　纖維素酶合成的調控 T1 Reesei 纖維素酶的合成受纖維素的誘導而受易利用的 糖阻遏。因為纖維素的不溶性 ,不能進入細胞 ,並不是纖維素 酶的直接誘導物。早在 1962 年 ,科學家就發現槐二糖是 T1Reesei 較強的誘導物。人們設想槐二糖是通過將纖維二糖β-葡萄苷酶的轉糖作用形成的 ,可能是 BGL Ⅱ的作用。然而 還沒有最終證明它是否是纖維素酶的直接誘導物。亦未證明 纖維二糖和其它的纖維素水解的氧化產物或木二糖也是否是直接誘導物。

        另外 ,纖維二糖作為誘導物比較複雜 ,在高水平時 ,它抑製了纖維素酶的生成。通過缺失突變檢測單一的纖維素酶組分在產生其它組分的誘導物中的作用時發現 cbh2或egl2缺失使得其它纖維素酶基因不能表達 ,bgl1基因缺失突變使得內切葡萄糖苷酶活性降低和 cbh1、 cbh2、 egl1 和 egl3 轉錄延遲。表明 CBHⅡ和 EGⅡ在誘導物的生成中起重要作用 而BGL Ⅰ則有部分作用。 T1 Reesei 纖維素酶的合成為轉錄水平調控。菌株 QM9414cbh1 ,cbh2 ,egl1 ,egl2 和 egl5 的表達是通過轉錄因子調節的。編碼轉錄因子ACEⅠ和ACEⅡ的基因連接在 cbh1啟動子的部位。ACEⅡ和Aspergillus niger 轉錄激活物 XINR 同源,ACEⅡ也刺激了纖維素酶和木聚糖酶基因表達。 分解代謝物阻遏蛋白 CREⅠ阻礙了 T1 Reesei 纖維素酶基因的轉錄。T1 Reesei Rut C - 30是高產纖維素酶菌株 ,有 cre Ⅰ基因突變。有葡萄糖時 ,仍產生纖維素酶 ,沒有葡萄糖時 ,酶會有低水平的合成。

        因此細胞中可能存在分解阻遏和能量狀 態之間的聯係。對四種絲狀真菌研究表明 ,在胞內 ATP濃度 在 10 - 7mgΠ ml 以上時 ,胞外纖維素酶產生受阻 ,且 cAMP在酶合成的阻遏中有重要作用。纖維素酶合成的低水平可能允許 誘導物的繼續生成 ,通過有限的纖維素的水解 ,從而調節纖維素酶產生的進一步誘導。槐二糖或其它誘導物通過轉錄激活 因子ACEⅠ和ACEⅡ的作用機理還不清楚。 T1fusca纖維素酶基因表達在兩個水平調控:纖維二糖誘導和葡萄糖存在時的分解代謝物阻遏。沒有纖維素或纖維二糖時 ,CelR阻遏纖維素酶的產生。

        然而纖維二糖作為誘導物 激活 CelR ,從而使其從啟動子上解離 ,使得纖維素酶基因轉錄。有葡萄糖時 ,分解代謝物阻遏可能通過 cAMP水平調 節。在有纖維二糖時 ,許多菌株的纖維素酶產量很高而在有 木聚糖、明膠、澱粉時 ,產量較低 。這說明在葡萄糖中時 ,纖維素酶為組成型表達 ,纖維素酶產物受分解代謝物阻遏。 C1 hermocellum 在碳源受限時形成纖維素酶小體。在C1thermocellum 指數期末和靜止期初期發現了 celA和celD ,然 而celF 隻出現在靜止期初期。        

        因此 ,纖維素酶的合成可能是分解代謝物阻遏的負調節 ,然而纖維素酶小體會受到所用碳 源的影響。如用纖維素作為碳源比用纖維二糖所產生的外切 葡萄糖苷酶多。C1thermocellum 纖維素酶小體在纖維素中時產 生 ,但如在可溶性碳如葡萄糖、果糖、纖維二糖甚至 CMC中時不產生。然而 , C1cellulovorans 在纖維二糖和 CMC中有高酶活力。這說明在可溶碳纖維素酶可能產生但纖維素酶體的裝配和從細胞壁解吸需要一些不溶微晶纖維素的存在。Do2erner , et al 報道在 celA和 celC被纖維素誘導時基因進行組成 型表達 ,然而 ,Wang , et al 報道纖維糊精酶 celA 和 celE都為纖 維素誘導。

 

2 　纖維素酶基因的結構 在細菌和真菌中 ,編碼纖維素酶的基因都位於染色體上 

        真菌纖維素酶基因通常隨機地分布於整個基因組中 ,每個基 因有其自己的轉錄調節單位。T1 Reesei cbh1 ,cbh2 ,egl1 ,egl2的 啟動子比較發現 CRE1結合位置的存在(1) 。ACEⅠ和 ACEⅡ通過結合於 cbh1啟動子部位而激活轉錄。細菌纖維素酶基因在基因組中或隨機分布或形成基因 簇。C1cellulovorans 基因簇大約22kb ,包含9個纖維素酶基因 ,3’側翼區有推定的轉座酶基因 ,在 C1cellulolyticum 和 C1 ace2tubutylicum 中亦發現相似的結構。在這些基因簇中 ,有轉錄終止子 ,然而啟動子基因還未發現。

 

3 　基因複製和水平基因轉移解纖生物中 ,相關生物或同一生境遠緣生物之間有大量 同源纖維素酶基因。這表明存在染色體重排或水平基因轉 移。類似 P1chrysosporium CBH1 基因簇說明基因複製現象。但如纖維素酶和半纖維素酶 ,可能表明同一祖先基因經曆較 大的底物特異性趨異變異。超嗜熱微生物巨酶催化區的不同 結構排列和多 CBM很可能起源於基因穿梭。 水平基因轉移在纖維素酶基因進化中作用隻是最近才有證據 , C1cellulovorans 基因簇可能通過轉座方式形成。厭氧真菌的葡萄糖水解酶基因無內含子 ,懷疑從細菌中得。Vallve ,et al的分析研究表明 ,厭氧真菌有可能從細菌中獲得纖維素酶基因 ,瘤胃的高微生物濃度為水平基因轉移提供條件。現已證明瘤胃中的水平基因轉移現象。這表明了生境中基因組的可塑性。使厭氧真菌可以得到新的基因。

 

4 　纖維素酶分子結構 分解纖維素的真菌和細菌 ,其纖維素酶基本是多結構域的 ,隻有個別是單結構域。一般的結構域都有催化區 ,它通過一柔性的多鏈接區連於 CBD上。此結構主要在非複合的纖 維素酶係中。複合酶係的酶更加多樣。纖維素酶小體至少包括一個催化區連於 CBD上。然而有的酶包含多個 CBD ,一個纖連蛋白 Ⅲ型區和一個類似 IG區域。最複雜的酶是那些極端嗜熱細菌。厭氧超嗜熱 Caldicellulosiruptor TOK7B11 巨酶通常有兩個催化區 ,一個纖維素酶區 ,一個半纖維素酶區 ,通過幾個 CBD連接。 真菌和細菌纖維素酶結構有一定區別。真菌連接橋一般富含 Gly、 Ser和 Thr ,而細菌則完全由 Pro - Thr 這樣的重複順 序組成 ,真菌 CBD由 33 - 36 個氨基酸組成 ,且具有高度的同源 ,而細菌由100 - 110 個氨基酸組成 ,同源性較低。另外 ,在分子形狀上 ,真菌 CD、連接橋和 CBD呈直線連接 ,而細菌連接 橋、 CD、 CBD之間呈135°。 T1 reesei CBHⅠ的 CBD是一個β折疊片形成的楔形結構 ,一麵疏水 ,一麵親水。疏水麵與底物表麵接觸 ,而後者是兩個 β折疊片麵對麵形成β三明治( sandwich) 。但它們吸附麵相似都較平坦暴露幾個芳香氨基酸及一些潛在氫鍵形成的殘基。 

 

        如上所述 ,纖維素酶的分子生物學方麵還有許多不清楚的地方。相信隨著研究者的不斷努力會使其逐漸發展完善。