2 病毒的超低溫保存法
2.1 一般概念
大多數微生物可用超低溫保存，超低溫保存法是適用範圍最廣的微生物保存法。 需要複雜營養的微生物種，如用其他的貯存方法不能保持其活力（如植物的病原性真 菌） ，通常可用超低溫的方法保存（ATCC 1983；Halliday，Baker 1985） 。
此法是將凍存 在小管或安瓿裏的細胞以較慢的冷凍速率（1℃／分鍾）冷凍，直至—150℃，再將這些小管 貯存在—150～－196℃的液氮中。 超低溫的冷凍保護劑不同於凍幹法所用的冷凍劑。ATCC 常用一種由甘油（10％） 、二甲亞碸（5％）和培養液製成的混合劑保存多數的細胞株。這些化學試劑進入細胞內可避免內膜的冷凍損傷。貯存在低溫容器內的細胞複蘇時必須小心操作。當小管被加熱時，所形成的冰晶會將細胞殺死，正確操作就可避免這種事故。隻要迅速將樣品解凍就能減少活力的丟失，做法是：將封口的小管迅速放入 37℃的水中，直至所有的冰融化，然後打開管口，將內容物移入培養基。超低溫保藏的微生物必須始終貯存在溫度非常低的環境中，因此需要液氮罐。在長期貯存 的過程中必須經常注意補充液氮。這種貯存方式比凍幹法需要更多的經費，包括為了維持貯存溫度所必要的勞動力和液氮等。
2.2 材料
病毒超低溫保存所需材料有：熱收縮塑料管（Nunc Cryoflex） ，液氮罐，防護手套和麵罩，永久性記號筆，氣體噴燈，裝液氮的保溫瓶。
2.3 方法
（1）剪一段兩端各超出冷凍管長度 2cm 的熱收縮塑料管。
（2）將含有澄清病毒懸液（組織培養的上清培養基，或組織培養基內的細胞溶解產物均可）冰浴幾分鍾，用滅菌移液管將 0.2ml 冰浴過的上清懸液分裝到冷凍管內，並將蓋子擰緊。
（3）將有病毒的冷凍管放入熱收縮塑料管中部，插入正確的標簽。
（4）用噴燈小心加熱熱收縮塑料管，並使之包住冷凍管。注意不要用太高的溫度加熱熱收縮塑料管。
（5）再小心加熱熱收縮塑料管的兩端，用大號鑷子夾緊管的端口至完全密封。
（6）將密封好的冷凍管快速在裝有液氮的保溫瓶中冷凍（操作時要求戴麵罩和手套） 。
（7）將冷凍過的冷凍管放入液氮罐中的格子內，同時記錄樣品的詳細的存放位置、實驗編號和存放日期等。
（8）需要用時，迅速從液氮罐內取出所需樣品，並投入 37℃水浴箱中解凍後，用解剖刀片在冷凍管的矽化墊圈處切開熱收縮塑料管。擰開冷凍管的蓋子時不需要除去熱收縮塑料管。
3 低溫保存法
3.1 材料
（1）培養基：
2 號營養肉湯粉（Unipath） 2.5g
甘油（Sigma） 15ml
蒸餾水 85ml
將上述材料混勻後，分裝在 5ml 瓶內，在 121℃下滅菌 15 分鍾。
（2）厭氧菌用 BGP 培養基〔其中不加瓊脂，而加 15％（體積比）甘油〕 ：
胰蛋白腖（Unipath） 1.0g
氯化鈉 0.5g
牛肉提取物 0.3g
酵母提取物 0.5g
鹽酸半胱氨酸 0.04g
葡萄糖 0.1g
磷酸氫二鈉 0.4g
甘油 15ml
蒸餾水 85ml
將上述材料混勻後，分裝在 10ml 瓶內，在 121℃下消毒 15 分鍾。以上兩種培養基使用前均能在 4℃環境中存放幾個月。
（3）玻璃珠：將直徑為 2mm 的玻璃珠（Creative Beadcraft Ltd；mersham，Buckinghamshire，UK）按上述凍幹法中的清洗法清洗。
（4）冷凍管：在 2ml有蓋冷凍管（Nunc，Paisley，Scotland）內存放 20～30 粒清洗好的玻璃珠，蓋好蓋後置 121℃下消毒 15 分鍾。消毒過的冷凍管可在室溫下保存。
此外，將超低溫冰箱預先冷卻到—70℃，滅菌塑料加樣頭。
3.2 方法
（1）用非選擇性固體培養基（如營養瓊脂或血瓊脂）在適宜細菌生長的條件下培養細菌。
（2）無菌條件下加 2ml 細菌懸浮液至營養肉湯中。
（3）用一支無菌的塑料環將細菌和肉湯混勻（細菌的最終濃度為 108～1010 個細胞／ml） 。
（4）按凍幹法在無菌條件下將細菌分裝到有滅菌玻璃珠的冷凍管內，反複吹打幾次，使珠子內部的氣泡完全被細菌懸浮液所替代。
（5）吸去冷凍管內多餘的液體。
（6）將混有細菌和珠子的冷凍管放在架子（Jencons Scientific Ltd，Leighton，Buzzard，Bedfordshire，UK）上，然後將架子放入—70℃的冰櫃內。
（7）從冰櫃中取出一支冷凍管，在無菌條件下打開，用滅菌鑷子從管中取出一粒珠子，然後迅速將管子放回冰櫃，以免管子內的其餘珠子融解。
（8）直接將珠子接種到固體培養基上或液體培養基中，在適當的條件下培養。
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