微生物的純種分離技術

 

在自然界中，各種微生物之間並不是離群索居，彼此老死不相往來的。在任何天然環境中，都有多種微生物共同生活。土壤是微生物的大本營，1克普通的菜園土中就有數百種微生物，個體數量可能超過上億。連人的口腔中也有幾十種細菌。由於巴斯德對葡萄酒變質的研究，人們認識到某種微生物和物質的某種化學變化有直接關係，酵母菌可以把葡萄酒裏的葡萄糖變成酒精，醋酸細菌可以使葡萄酒變酸。巴斯德和其他一些學者的工作又證明傳染病是由某些微生物感染所致。既然每種微生物有不同的形態和生理特征，他們在自然界的作用和對人類的影響也必然有差異。我們要了解某種微生物對於人類有害還是有益，或者目前與人類還沒有什麽特別密切的關係，就必須單獨把這種微生物分離出來研究。這就是在無菌技術的基礎上微生物學的另一項基本技術——純種分離技術。

　　要從含有成億個細胞，成百個種類微生物的樣品中分離出某種微生物，並不是容易的事。第一個成功地分離出純種細菌的，是前麵提到過的在手術中采用消毒劑的醫生李斯特。關鍵在於他發明了一種可以取出數量可以小到0.00062毫升牛奶的微量注射器。因為這樣才可能使樣品中的微生物盡可能少。他用不含任何微生物的滅過菌的水稀釋極少量的牛奶，再把稀釋的牛奶分裝在幾個滅過菌的酒杯中，成功地分離出現在還在製造酸奶中采用的乳酸鏈球菌。這種方法經過100多年的改進，現在仍然是一種分離純種微生物的常用方法，叫做係列稀釋法。

　　李斯特的方法畢竟太麻煩了。比李斯特早幾年，有位科學家把要分離的樣品用滅菌後的水稀釋後放在煮熟的馬鈴薯片上，在溫暖的地方培養幾天後，馬鈴薯上長出星星點點的五顏六色的菌落。當時這位科學家認為至少有一部分菌落是由一個細胞繁殖形成的，如果重複幾次，就可以分離到純培養物。不過，真正解決問題的純種分離方法，是著名的德國醫生，偉大的微生物學奠基人之一科赫和他的研究小組建立起來的。科赫在明膠中加上一些營養物質（例如肉質），加熱融化後倒在一片滅過菌的玻璃片上，待其凝固後，用在火焰上燒紅過，因而燒死了全部原來附著的微生物的白金絲蘸上一點要分離的樣品（因為白金絲燒紅後很快便會冷卻，立即用來蘸樣品時也不會燒死樣品中我們需要分離的微生物。現在我們用電爐絲代替，價格便宜多了，這就是我們今天常見的接種針），在凝固的明膠上輕輕劃動，使樣品中的很少量微生物沾在明膠上，然後用玻璃罩蓋上玻璃片，以防空氣中的雜菌落下汙染。幾天後，明膠板上便長出一個個彼此分開的菌落。這種方法叫做劃線分離法。由於明膠是透明的，所以很容易觀察。但是，明膠在攝氏20多度會融化，在一般細菌生長需要的37度下不能成為固體，菌落便不可能形成。科赫的助手黑塞在他妻子的提示下，發現用洋菜（學名叫瓊脂，一種做果醬的植物膠）代替明膠，可以克服明膠在37℃會融化的缺點；另一位助手又設計了一種圓形的有邊的，可以對著蓋起來的培養器具，使得融化的洋菜或明膠不會隨便亂流，又可以避免汙染雜菌，這就是每個微生物學工作者都非常熟悉的培養皿。從19世紀80年代起，這些分離微生物的特殊用具，成了微生物學實驗室必備的特征性物品，至今依舊。

　　我們馬上我們會提出一個疑點：這些在馬鈴薯片或瓊脂上長出的菌落真是由一個微生物細胞繁殖來的嗎？可能不是。為了排除這個疑點，當時人們采用反複多次，並仔細用顯微鏡檢查的辦法。後來，有人發明了可以在顯微鏡下用極細的玻璃絲挑取單個細胞的工具——單細胞分離器，純種分離的技術便成熟了。長期實踐的經驗告訴我們，盡管不用單細胞分離器有一定風險，但是用稀釋法或劃線分離法，在適當重複操作後，在很大程度上可以達到純種分離的目的。

　　為了獲得單一類型微生物，即純培養物，微生物學家通常采用稱作富集培養的技術。所謂富集，就是指在分離純培養之前，通過這種技術使需要分離的對象在培養基中盡量生長得多一點。為了富集，首先要選擇好適合對象微生物的培養基，微生物學家稱為選擇性培養基。例如，當我們想分離有固氮作用的細菌時，在培養基中可以加糖，但不能用含氮的營養物。在這種培養基中加入一小撮土壤，便隻有那些能夠利用大氣氮的微生物得以生長，因此該培養物就會富含固氮細菌。自然，一旦它們開始生長，有些固定下來的氮就會被土壤接種物中的其它細菌所利用，而隨著後者的生長，培養物將變得相當混雜。但培養物中會富含固氮細菌，至少在培養初期是如此。同樣，若想得到硫細菌，可在培養基中保留銨鹽，並以含硫的營養物取代糖；以硫酸鐵代替糖則有助於鐵細菌的生長。還可以采用不變更培養基組成而隻改變酸度的辦法，因為弱酸性含糖培養基有利於酵母菌和黴菌的生長，而細菌卻不喜歡這種環境。要分離厭氧細菌，可以讓培養基和空氣隔絕，簡便的方法是使培養基裝滿到瓶口並塞緊來富集。

　　根據同樣的原理，我們如果想得到具有某種特定功能的微生物，首先可以用選擇培養基來進行富集。如果我們想得到能夠分解橡膠或塑料的微生物，就可以在培養基中加進橡膠或塑料。雖然我們在自然界中可以見到一些對簡單的富集技術無動於衷的微生物，但一般說來，富集培養是尋求微生物純培養的第一步。

　　然而，醫學微生學家不太采用富集培養方法，原因很簡單，因為從一位受感染的患者身上取得的樣品就是一份富集培養物，因此醫學科學可立即進行第二步工作，即從富集了的微生物中把純菌株分離出來。

　　不過我們在實驗室中分離純化的微生物是否與自然界實際存在的完全一致呢？這是個問題。已故的荷蘭卓越微生物學家克魯維教授早就指出，所有的細菌培養物均是實驗室的人工產物，為了適應實驗室的生長條件，這些微生物的特性已經起了變化。一個簡單的例子是引起傷寒的細菌傷寒杆菌，當剛從傷寒病患者體內分離出來時，常常需要向培養基中補加一種氨基酸促進它們生長，但在實驗室中培養幾次後，它們容易喪失此種特性，即變得能夠自己製造這種氨基酸了，當用該菌株去感染實驗動物並再度分離它時，它又恢複了需要氨基酸的這一特性。微生物具有驚人的適應性，由此可見一斑。所以我們必須牢記，不要把實驗室中微生物材料的表現完全等同它們在自然環境中的情況。