微生物的染色觀察

染色觀察

為了提高觀察效果，被觀察的對象也要進行處理。開始，微生物學家在用光學顯微鏡觀察細菌的時候，由於懸浮在液體中的細胞既微小又透明，觀察起來非常困難。後來發現細胞可以用染料染色，而且不同的細胞結構對不同染料有特異的反應，甚至不同種類微生物對同種染料的著色情況也不同。最著名的例子是丹麥科學家革蘭（Chriatian,Gram）在1884年發明的一項重要的觀察細菌的方法。

 

這個方法是把細菌塗在載玻片上在酒精燈上烘幹，用結晶紫染色，再用碘液處理，然後用酒精浸洗，看細胞是否能保留染料。結果發現有些細菌能保持紫色，另一些卻褪色。這種現在仍然在廣泛使用的革蘭氏染色反應對於細菌的鑒定具有很高的價值，而且後來發現根據這個染色反應區分的革蘭氏陽性細菌（能夠保留染料，故細菌呈紫色）和革蘭氏陰性細菌（不能保留染料而被番紅花紅染成紅色）在許多生理特性上有區別，例如革蘭氏陽性細菌對青黴素和磺胺類藥物特別敏感。現在知道這是因為兩類細菌的細胞壁有很大的差異。

　　用染料染色細菌的方法很多，不同的微生物可以用不同的染料，不同的細胞器官也可以采用不同的染料，例如可以用一種稱之為嗜酸染色的方法識別引起麻風的分支杆菌，用印度墨汁染色細菌的莢膜，用孔雀綠染色芽孢，等等。

 

　　除了用各種染料染色樣品以便清楚地觀察微生物外，後來又發明了用各種可以發熒光的物質來染色微生物樣品。例如現在可以用一種熒光染料來區分革蘭氏陽性和陰性細菌。

 

電鏡樣品製備

用電子顯微鏡觀察的樣品也要經過認真細致的處理，以至於今天出現了一門非常有用的技術科學—電子顯微鏡學。電子顯微鏡觀察樣品的方法很多，基本上可以分為透射型和掃描型兩類。前者是電子流通過觀察樣品而形成圖象；後者則是用來觀察微生物的表麵細節，分辨率大約在7納米左右。待觀察的樣品則必須進行相當複雜的處理，而且有些處理方法是和用光學顯微鏡觀察時很不相同的，因為在進行電子顯微鏡觀察時受到一些特殊限製。首先，由於樣品處於高真空環境中，樣品必須盡可能保持原狀，所以微生物樣品要進行固定和脫水處理；第二，要使電子束全部透過樣品，所以樣品必須盡可能薄；第三，為了便於觀察，圖象的反差要大，光學顯微鏡是靠光的吸收差異來達到，而電子顯微鏡則靠電子散射程度，決定電子散射程度的是元素的質量和厚度，為此常用重金屬處理，例如金、鉑等處理。

　　投射電子顯微鏡的觀察樣品的主要製備方法是：

 

1、投影法。在真空條件下，用電子散射能力強的重金屬原子來噴鍍樣品表麵，這樣在樣品和沒有噴鍍的區域形成了較強的反差，而沒有噴鍍的部分成了樣品的投影，根據投影我們可以了解樣品的立體形狀、高度，通常用這種方法來觀察細菌的鞭毛或病毒的顆粒。

 

2、負染法。因為這種方法是將樣品的背景染色以突顯樣品，所以稱為負染。一般是用電子密度高，本身不會顯示任何結構，又和樣品不起反應的物質，例如磷鎢酸的鈉鹽將樣品包圍，同時染色劑還會投入觀察對象的內部，這樣，既能顯示外形，又可在一定程度上反應樣品的內部結構。用這種方法可以觀察細菌細胞、病毒等。

　　3、超薄切片法。這是最常用的方法，因為可以觀察細胞或其它樣品內部的細微結構。通常是要按照一定程序對樣品進行固定，脫水，然後包埋在樹脂中作為支持物，用超薄切片機切成極薄的切片。因為隻有在20—100納米厚度的切片用投射電子顯微鏡才能觀察，所以一般細菌樣品，一個細胞要分割成10片到50片。

 

4、冰凍蝕刻法。所謂冰凍蝕刻，是把樣品放在-196℃的液態氮中迅速冷凍，然後加溫到-100℃，使樣品變得非常脆弱易碎，再用預先也冷卻到-196℃的非常鋒利的玻璃斷口切割經冷凍的樣品，這樣使樣品在最容易斷裂的部位斷開（如果是微生物細胞，則多半是沿內膜中部），然後讓樣品放在真空條件下升華掉斷口處的冰，最後用重金屬噴鍍該斷口表麵，即可用電子顯微鏡觀察其結構。用這種製備方法的優點是可以避免在固定、脫水和包埋過程中造成細胞結構的人為改變而形成的假象。

 

　和投射電子顯微鏡是靠透過物體的電子成像不同，掃描電子顯微鏡的成像是靠觀察物體表麵發射的電子。掃描電子顯微鏡是用聚焦得很細的電子束在樣品表麵掃描。電子激發樣品表麵的原子放電，釋放出微細的電子簇（二次電子），用靈敏的檢測裝置可以捕獲它們，然後通過類似電視機的原理將樣品圖象呈現出來。二次電子對檢測器的作用取決於樣品表麵的性質，當電子激發樣品表麵突起部位時，會有大量二次電子進入檢測器，而表麵凹陷處則隻有少量二次電子進入，所以可以顯出反差突出、明暗清晰的三維圖象。而且它的成像焦深較長，圖象的立體感強，和肉眼所見差別不大。製備掃描電子顯微鏡的樣品也先要經過固定、脫水等處理，以免在真空條件下變形失真，為了獲得較多的二次電子，表麵要噴塗重金屬和碳原子。