土壤微生物分離與純化實驗原理和方法

 

一、實驗目的 

了解血球計數板的構造、計數原理和計數方法，掌握顯微鏡下直接計數的技能。

 

二、實驗原理 

測定微生物細胞數量的方法很多，通常采用的有顯微直接計數法和平板計數法。

 

顯微計數法適用於各種含單細胞菌體的純培養懸浮液，如有雜菌或雜質，常不易分辨。菌體較大的酵母菌或黴菌孢子可采用血球計數板，一般細菌則采用彼得羅夫· 霍澤（Petrof Hausser）細菌計數板。兩種計數板的原理和部件相同，隻是細菌計數板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計數板較厚，不能使用油鏡，計數板下部的細菌不易看清。

 

血球計數板是一塊特製的厚型載玻片，載玻片上有4條槽而構成3個平台。中間的平台較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上麵各有一個計數區，計數區的刻度有兩種：一種是計數區分為16個大方格（大方格用三線隔開），而每個大方格又分成25個小方格；另一種是一個計數區分成25個大方格（大方格之間用雙線分開），而每個大方格又分成16個小方格。但是不管計數區是哪一種構造，它們都有一個共同特點，即計數區都由400個小方格組成。

 

計數區邊長為1mm，則計數區的麵積為l mm2，每個小方格的麵積為1/400mm2。蓋上蓋玻片後，計數區的高度為0.1mm，所以每個計數區的體積為0.1mm3，每個小方格的體積為1 /4000mm3。

   

 

  

使用血球計數板計數時，先要測定每個小方格中微生物的數量，再換算成每毫升菌液（或每克樣品）中微生物細胞的數量。 

已知：1mm3體積=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm3 

所以：1mm3體積應含有小方格數為1000mm3/1/4000mm3=4×106個小方格，即係數K=4×106 。 

因此：每ml菌懸液中含有細胞數= 每個小格中細胞平均數（N）×係數（K）×菌液稀釋倍數（d）

 

1．活材料：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜麵或培養液。 

2．器材：顯微鏡、血球計數板、蓋玻片（22mm×22mm）、吸水紙、計數器、滴管、擦鏡紙。

 

四、實驗方法   

1．視待測菌懸液濃度，加無菌水適當稀釋（斜麵一般稀釋到10-2），以每小格的菌數可數為度。 

2．取潔淨的血球計數板一塊，在計數區上蓋上一塊蓋玻片。 

3．將酵母菌懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計數板中間平台兩側的溝槽內沿蓋玻片的下邊緣摘入一小滴（不宜過多），讓菌懸液利用液體的表麵張力充滿計數區，勿使氣泡產生，並用吸水紙吸去溝槽中流出的多餘菌懸液。也可以將菌懸液直接滴加在計數區上，不要使計數區兩邊平台沾上菌懸液，以免加蓋蓋玻片後，造成計數區深度的升高。然後加蓋蓋玻片（勿使產生氣泡）。 

4．靜置片刻，將血球計數板置載物台上夾穩，先在低倍鏡下找到計數區後，再轉換高倍鏡觀察並計數。由於生活細胞的折光率和水的折光率相近，觀察時應減弱光照的強度。 

5．計數時若計數區是由16個大方格組成，按對角線方位，數左上、左下、右上、右下的4個大方格（即100小格）的菌數。如果是25個大方格組成的計數區，除數上述四個大方格外，還需數中央l個大方格的菌數（即80個小格）。如菌體位於大方格的雙線上，計數時則數上線不數下線，數左線不數右線，以減少誤差。 

6．對於出芽的酵母菌，芽體達到母細胞大小一半時，即可作為兩個菌體計算。每個樣品重複計數2—3次（每次數值不應相差過大，否則應重新操作），求出每一個小格中細胞平均數（N），按公式計算出每ml（g）菌懸液所含酵母菌細胞數量。