細菌的轉化與平板篩選

 

 感受態是指細菌處於容易吸收外源DNA的狀態。轉化是指質粒DNA或以它為載體構建的重組子導人細菌的過程。其原理是細菌處於0℃，CaCl₂低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形。轉化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基—鈣磷酸複合物粘附於細胞表麵，經42℃短時間熱擊處理，促進細胞吸收DNA複合物。將細菌放置在非選擇性培養基中保溫一段時間，促使在轉化過程中獲得的新的表型(如Amp^r等)得到表達，然後將此細菌培養物塗在含有氨苄青黴素的選擇性培養基上。

 

重組質粒轉化宿主細胞後，還需對轉化菌落進行篩選鑒定。利用α互補現象進行篩選是最常用的一種鑒定方法。現在使用的許多載體都具有一段大腸杆菌β半乳糖苷酶的啟動子及其編碼α肽鏈的DNA序列，此結構稱為lacZ'基因。lacZ'基因編碼的α肽鏈是β半乳糖苷酶的氨基端的短片段(146個氨基酸)。任何攜帶著lacZ'基因的質粒載體轉化了染色體基因組存在著此種β半乳糖苷酶突變的大腸杆菌細胞後，便會產生出有功能活性的半乳糖苷酶，在IPTG(異丙基β—D—硫代半乳糖苷)誘導後，在含有Xgal(5-溴-4-氯-3-吲哚-6-D-半乳糖苷)的培養基平板上形成藍色菌落（半乳糖苷酶能將無色的化合物Xgal切割成半乳糖和深藍色的底物5-溴-4-靛藍）。而當有外源DNA片段插入到位於lacZ'中的多克隆位點後，就會破壞α肽鏈的閱讀框，從而不能合成與受體菌內突變的β半乳糖苷酶相互補的活性α肽，而導致不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶，也就不能分解Xgal而顯藍色，因此含有重組質粒載體的克隆往往是白色菌落。

 

  超淨工作台、低溫離心機、恒溫搖床、恒溫箱、恒溫水浴、離心管、試管、培養皿、錐形瓶、接種針、玻璃塗棒、酒精燈、鑷子、牙簽、大腸杆菌DH5a 、質粒

 

0.1mol／L CaCl₂溶液 LB液體培養基 LB固體培養基 

氨苄青黴素(Amp)：用無菌水配製成100mg／mL溶液，置—20℃冰箱保存。

Xgal：將Xgal溶於二甲基甲酰胺，配成20mg／mL，不需過濾滅菌，分裝小包裝，避光貯存於-20℃。

IPTG：取2g IPTG溶於8mL雙蒸水中，再用雙蒸水補至10mL，用0.22um濾膜過濾除菌，每份1mL，貯存於-20℃。

 

(一) 製備感受態細胞

1、吸取15µl E.coil菌液，接種於20ml LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜，待OD₆₀₀=0.5左右將該菌懸液以1：50接種量轉於50ml LB液體培養基中，37℃振蕩擴大培養，當培養液開始出現混濁後，每隔20-30min測一次OD₆₀₀，至OD₆₀₀=0.6左右，停止培養。

2、培養液轉入離心管中，在冰浴10min，4℃下5000rpm離心10min。

3、棄上清液，用4ml冰預冷的0.1M CaCl₂溶液輕輕懸浮菌體至均勻，冰上放置30min。

4、4℃下5000rpm離心6min。

5、棄上清液，用2ml冰預冷的0.1M CaCl₂溶液輕輕懸浮菌體至均勻，冰上放置片刻後即製成感受態細胞懸液。

6、以上製好的感受態細胞懸液可在冰上放置，24小時內直接用於轉化實驗，也可加入15%高壓滅菌過的甘油，混勻後，分裝於1.5ml離心管中，每管100µ l感受態細胞懸液，置-70℃條件下保存。.

(二) 質粒DNA轉化大腸杆菌

1、取100µl搖勻後的感受態細胞懸浮液（如是冷凍保存液，則需化凍後馬上進行下麵的操作），加入5µl連接產物，輕輕搖勻，冰上放置30min後，於42 IPTG水浴中保溫90s，然後迅速在冰上冷卻2min。

2、加入900µl LB液體培養基，則總體積約1ml，混勻於37℃振蕩培養90分鍾使受體菌恢複正常生長狀態並使轉化體產生抗藥性Amp^r。

 3、在預製的LB瓊脂平板上，加40uL 20mg／mL的Xgal和4uL 200mg／mL的IPTG溶液，並用滅菌玻璃推子(酒精燈上燒後冷卻)，均勻塗布於瓊脂凝膠表麵，37℃倒置吸收。

4、將恢複培養的菌體4000rpm離心5min，移去上層900µl LB培養基，用餘下的100µl重懸菌體至均勻。

(四) α互補現象的檢查

將重懸菌體均勻塗布於含X-gal+IPTG+氨苄青黴素的LB平板上，37℃倒置培養12—24h，出現菌落。其中白色菌落從理論上講為重組克隆。

如果進一步驗證，可挑取多個白色菌落分別接種到1ml含有氨苄青黴素的LB液體培養基中，37℃振蕩培養6-8h，然後提取質粒酶切驗證，或進行菌落PCR擴增鑒定。